易基因｜一文看懂：ChIP实验和qPCR定量分析怎么做

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染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。

想要获得理想的ChIP结果，选择适合的抗体固然很关键，ChIP 流程中所有步骤也很重要。本文对ChIP实验之前的准备、获得理想ChIP结果步骤、ChIP的qPCR定量分析和ChIP案例分析进行总结，希望帮助到正在做ChIP实验和qPCR定量分析的您。

开始 ChIP 之前要考虑三件事

（1）为您的实验查找适合的抗体

（2）优化染色质剪切

（3）评估您的 ChIP 实验能否成功

五个步骤获得理想 ChIP 结果

Step1：交联和裂解——稳定复合物并分离核组分

第一步对时间要求严格并且需要优化。体内共价交联稳定蛋白质-DNA相互作用并于特定时间点进行分析。通常采用甲醛交联，加入甘氨酸以终止反应。交联剂渗透到完整细胞中并将蛋白质-DNA复合物锁定在一起从而进行分析。交联剂在整个过程中保持复合物稳定，但其作用必须是可逆的才能用于ChIP。一些非常稳定的蛋白质-DNA相互作用则不需要交联。

接下来，使用裂解液透化细胞膜，释放细胞组分，然后蛋白质-DNA复合物变得可溶。去除细胞溶质蛋白以减少背景信号并增加灵敏度。

注意：此时可以停止ChIP测定。经过交联，淬灭和洗涤细胞沉淀后，将裂解物于-80℃储存。

Step2：染色质片段化——DNA片段化

细胞核材料片段化是获得良好的ChIP 分辨率的关键因素，理想情况下的片段大小在 200 到 800 bp对之间。剪切是最难控制的步骤之一。通过超声处理和/或核酸酶/酶促消化可以实现剪切，各有利弊。超声处理需要大量的手动操作时间，但非常适合难以裂解的细胞；酶促消化不需要手动操作，适用于大量样品的处理，但其剪切位点不是随机的。两种方法都需要根据具体细胞系进行优化。

注意：此时可以停止ChIP。经过剪切/消化染色质后，可以将样品于-80°C储存。避免反复冻融。

Step3：免疫沉淀——捕获并分离蛋白质-DNA复合物

使用抗体捕获蛋白质-DNA复合物中的目标蛋白质是实验成功的关键因素。抗体免疫沉淀并从细胞核组分中分离蛋白质，去除不相关的细胞物质。

使用抗体结合磁珠完成所得抗体-蛋白质-DNA复合物的纯化。经过孵育后，充分洗涤磁珠-抗体-蛋白质-DNA复合物，纯化并洗脱蛋白质-DNA复合物。

Step4：制备DNA——解交联和DNA纯化

现在含有目标蛋白质的染色质片段已分离，需要解交联并纯化DNA。解交联通常采用高热孵育和/或消化来完成。

注意：此时可以停止ChIP。经过解交联和/或DNA纯化后，可以将样品于-20°C储存。

Step5：定量DNA——测定目标蛋白质-DNA水平

在该步骤中，通过qPCR定量纯化的DNA产物，通过qPCR，您可以确定目标蛋白是否存在于特定位点。

ChIP的qPCR如何定量分析

ChIP-qPCR 数据需要针对可变性来源进行标准化，包括染色质数量、免疫沉淀的效率（富集效率）和 DNA 回收率。

两种常用的标准化 ChIP-qPCR 数据方法——Percent Input法和富集倍数法（Fold Enrichmen）。与input相关的ChIP-qPCR数据包括ChIP的背景水平和input染色质的标准化。建议ChIP 实验重复，尽可能将结果与背景信号和标准误差一起显示。

Percent Input法

使用这种方法，从ChIP获得的信号除以从input样本中获得的信号。input样本代表ChIP中使用的染色质数量。通常1%的起始染色质用作input。

示例：计算input百分比

注意：如果起始input为1%，则从稀释input的Ct值中减去100或6.644 cycles（100的log2）的稀释因子（DF）。

富集倍数法

这种标准化方法也称为“背景信号”或“相对无抗体对照”。该方法将ChIP 信号除以无抗体信号，将ChIP信号表示为信号相对于背景信号的倍数增加。该方法建立在背景信号的水平在不同的引物组、样品和重复实验间可重复的假设上。背景信号水平在引物组、样品和实验之间有所不同。

示例：富集倍数计算

ChIP案例分析

项目文章｜ChIP实验分析揭示H3K27me3去甲基化酶在体细胞重编程调控转录机制

2020年10月8日，中国科学院广州生物医药与健康研究院/生物岛实验室秦宝明教授团队和Miguel A. Esteban课题组在Nature Communications杂志发表了题为"JMJD3 acts in tandem with KLF4 to facilitate reprogramming to pluripotency"的研究论文，该成果揭示了H3K27me3去甲基化酶JMJD3与KLF4在体细胞重编程中协同调控转录新机制，深圳易基因提供本研究中的部分测序分析服务。

标题：JMJD3 acts in tandem with KLF4 to facilitate reprogramming to pluripotency

发表时间：2020年10月8日

期刊：Nature Communications

影响因子：14.919

技术方法：ChIP-seq、RNA-seq、RT-qPCR等

作者通过对小鼠体细胞重编程过程中进行转录组和ChIP-seq等测序分析，揭示了H3K27me3去甲基化酶JMJD3与KLF4在体细胞重编程中协同调控转录新机制。首先，JMJD3对重编程有2方面相反的作用；在机制上，JMJD3被KLF4特异性地招募至上皮和多能性基因位点，并辅助KLF4激活这些基因。进一步，作者还在多种其他KLF4介导的细胞命运转变中验证了JMJD3的这一作用模式。因此，本研究对深入理解KLF4和JMJD3在相关发育、干细胞分化、生理和疾病条件下的复杂作用具有提示意义。

关于染色质免疫共沉淀测序技术（ChIP-Seq）

将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。

不同组蛋白的差异性修饰与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用某一修饰的特定组蛋白的特异性抗体富集与其结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。

技术优势：

（1）筛选范围广：全基因组范围内筛选特定组蛋白修饰与基因组DNA序列之间的关系

（2）微量样本：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展开测序分析

（3）方案灵活：根据不同的项目需求，选择不同的组蛋白修饰特异性抗体

有需要ChIP-seq测序分析和多组学合作研究的老师可以联系我们哦~~

参考文献：

thermofisher

doi.org/10.1038/s41467-020-18900-z