前言
目前已有大量的研究表明，表观遗传学，特别是DNA甲基化变化，伴随着疾病的早期发生到后期发展，并可作为临床疾病全过程管理（其中包括早期诊断、个性化医疗、复发检测、慢性疾病的风险评估等）的生物标记物。如通过检测手术切除的肿瘤组织的DNA甲基化变化，可辅助诊断治疗效果，其分子表征亦可成为预后的评判指标。利用血液，粪便，尿液或者其他生物样品中存在的cell-free DNA（cfDNA），可准确地检测到和肿瘤相关的DNA甲基化变化，甚至可以确定肿瘤的起源组织。这为开发简单、经济、高度特异性的肿瘤早筛产品提供了广阔的前景。此外，基于DNA甲基化的检测，在技术结构上相对简单，只需针对一个或几个基因就可以设计良好的测试技术体系。因此，与肿瘤相关的DNA甲基化变化已然成为极具吸引力的生物标记物，并在精准医疗中发挥巨大作用。
该报告基于目前的临床表观遗传学研究及已转化并注册的体外诊断检测（IVD）产品，总结DNA甲基化肿瘤生物标记物的检测技术、临床实践应用、检测性能分析和产品市场情况等，并讨论其发展障碍、监管障碍，以及如何影响知识产权（IP），及市场和医疗保健系统的未来。
一、 精准医疗中的表观遗传生物标记物（Biomarker）
肿瘤的主要诱导因素要归结于细胞的遗传变化，以及相关的基因功能和活性失调。但是，肿瘤并不单单是遗传疾病，其进展取决于多种生物学过程，例如免疫活性，组织微环境和表观遗传学变化等（Hanahan和Weinberg，2011年）。表观遗传学是基因组上的第二层编码信息，可指导基因组功能和活性，其作用机制主要有两个方面：（1）修饰能够改变基因组和/或蛋白质-DNA相互作用的三维构象的染色体蛋白质；（2）DNA链本身的化学修饰。 DNA三维结构的改变是通过在最简单的DNA结构核小体中心对组蛋白进行翻译后修饰而实现的。组蛋白修饰可引发染色质构象的紧密堆积并导致失活，因此改变DNA的开放性和可及性（分别表现为异染色质和常染色质）。对DNA的化学修饰，最典型的就是共价添加甲基（-CH3）到胞嘧啶的第5个碳原子位置，将胞嘧啶甲基化为5-甲基胞嘧啶（5mC）。一般而言，基因启动子中5mC会干扰基因转录，并可能导致转录基因失活。然而，DNA甲基化被认为是可逆的基因组变化，其功能等同于遗传变化，例如突变或缺失。在数十年的研究中，除上述两个方面，还发现多种其他表观遗传影响基因表达调控的机制。这些机制相互联系，在特定时间协调特定基因的表达，以提供特定的细胞表型。
对于特定的疾病表型，除了表观遗传调控之外，基因突变、拷贝数变异、转录异常都与之有着因果关系。因此需要使用不同的方法来理解复杂和多因素疾病的生理病理学过程。表观遗传在疾病发生发展过程中的特征变化，使得其成为重要的biomarker来源，可以用来辅助疾病早期诊断、进展监测、结局预测、按风险对患者进行选择和分级、预测未来的并发症，甚至可以评估特定患者亚群中治疗干预措施的积极或消极影响。此外，表观遗传变化，特别是DNA甲基化，明显比RNA和蛋白质更稳定，这使得表观遗传biomarker具备更好的临床应用可行性及实用性。即使在质量较差的样本中，例如福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，DNA甲基化也表现出很高的稳定性。与基于遗传或蛋白质的biomarker相比，表观遗传还具有以下优势：1）伴随疾病的动态特性；2）提供疾病相关基因的功能信息；3）传达疾病期间发生变化的特定遗传程序；4）尽管表观遗传变化具有多样性和复杂性，但仍在许多肿瘤组织之间或起源组织内表现出高度的一致性；5）多数检测表观遗传biomarker的技术（如RT-qPCR）已进行临床转化。因此，表观遗传学在提高对复杂疾病的预测性和精确性方面具有巨大的潜力。
2008年，美国国家研究委员会（National Research Council）在Toward Precision Medicin中将“精准医学”定义为：“根据每个患者的个体特征量身定制治疗方法...……根据对特定疾病不同的敏感性或对特定治疗的不同反应，将个体划分为不同亚群。可以将预防或治疗干预措施集中在潜在受益的人群，并为那些非受益群体节约治疗费用，减轻治疗副作用”。 因此，精准医学的展开，让表观遗传在临床应用中获得更为广阔的发展空间。而理想的表观遗传biomarker至少涵盖以下特性之一：i）预测未来疾病发展的风险； ii）检测疾病； iii）揭示有关疾病特征史的信息； iv）预测疾病的后果； v）预测对治疗的反应； vi）监测对治疗或药物的反应； vii）可以同时做出诊断并进行有针对性的治疗。
为了达到精确医学的目标，当前的挑战是如何为临床检测寻得可靠并有用的biomarker。为此，新的biomarker需要更高的精确度和性价比。而遗憾的是，在生物医学研究中发现的biomarker中，只有不到1%的比例，最终被应用到临床实验室，其中表观遗传biomarker的比例甚至更低。从表观遗传学的生物医学研究到临床检测产品转化率的数据中不难看出，由不同的利益相关者（即患者、提供者、支付者和监管者）形成的精准医学生态圈，需要加强对表观遗传在精准医学中的影响的认识，并通过更为紧密和广泛的合作，方可成功突破表观遗传技术在临床实践中的突破。
二、 体外诊断（IVD）检测开发流程及设计
虽然生物医学研究中，所获得到的绝大多数表观遗传的biomarker，或临床证据并不足以支撑其后续的临床应用。但这类研究研究仍明确了特定表观遗传biomarker的预期用途、所针对的临床需求以及患者群体中的目标人群（图1a）。特别是明确预期用途和目标人群，对于后期招募特定患者群体进行临床验证研究至关重要。
在IVD测试的开发过程中，biomarker（此处与疾病相关的甲基化变化）仅被视为IVD开发的两个条件之一。 在常规检测实践中使用biomarker需要第二个条件，即能够在临床样本中检测到biomarker的技术（图1b）。对于biomarker检测技术的评估，需要进行临床前测试，并依此开发检测原型产品（图1c）。如Global Harmonization Task Force的文件GHTF / SG1 / SG1 / N063：2011所述，该过程包括IVD检测特征的验证，例如灵敏度（空白限，检测限和定量限），特异性（检测唯一靶向标记的能力），准确度（真实系统误差，精密随机误差），测量范围（线性和非线性测量系统）以及检测所提供的测量临界值。
随后，该IVD检测原型需通过临床验证（图1d）后，方可作为IVD产品进行销售。临床验证是一项旨在衡量此IVD检测产品原型是如何准确地预测特定临床风险或存在的研究。测试的标准是通过验证诊断（临床）敏感性和特异性来衡量的。诊断敏感性是指在存在biomarker的情况下测试产生阳性结果的概率；而诊断特异性是在没有靶向标记物的情况下，检测所给出阴性结果的可能性。临床验证可以是回顾性的，也可以是前瞻性的，其目的在于结合目前已有的临床检测或应用，展示该IVD检测产品所能为临床带来的益处。总体而言，此类研究需要为前瞻性biomarker的应用，提供高质量的临床数据，以满足欧盟《体外诊断设备法规》（IVDR，EU 2017/746）的要求，并获得欧洲合格认证（CE），或符合美国食品药品管理局（FDA）的程序并获得批准。 只有满足这些要求，该IVD检测产品才被允许在临床上使用（图1e）。在随后的内容中，将对已经批准或处于开发状态的国内外表观遗传肿瘤IVD检测产品进行回顾分析。
三、 表观遗传IVD检测中适用样本类型
DNA上表观遗传biomarker的稳定性意味着几乎所有组织类型都可以作为检测样本，并用以设计基于DNA甲基化的检测技术。
1. 血液
血液是肿瘤生物信息的丰富来源，ctDNA通常是研究的首选样本类型，并可以用现有的技术方法检测ctDNA的甲基化水平。利用测序的方法，ctDNA片段末端可用于评估基因组活性和预测基因表达，而无需对肿瘤组织本身进行检测。虽然对ctDNA甲基化的检测处于早期研究阶段，但仍为肿瘤检测提供了更好的技术平台，其优势在于不需要接触肿瘤组织，也不仅仅依赖于一个表观遗传biomarker。然而在临床应用中不得不注意的是，血液中发现的大部分cfDNA来自有核血细胞，一部分来自血管内皮细胞和肝脏（Moss等人，2018年），只有极少部分是携带肿瘤信息的ctDNA。因此不恰当地处理血样可能导致检测背景嘈杂，可测信号几乎完全丢失，从而阻碍了检测的灵敏性与特异性。通过稳定血细胞，使用谨慎的血液处理方法，或利用特定的cfDNA收集管，或许可以降低这种风险。目前效果较好的收集管包括PAXgene Blood ccfDNA Tube (Qiagen), Cell-Free DNA Collection Tube (Roche), cf-DNA/cf- RNA Preservative Tube (Norgen Biotek) 和Cell-Free DNA BCT® (Streck)。
2. 尿液
尿液中cfDNA的来源可分为三类：肾前来源，（主要来源于体循环），肾，以及肾后来源于膀胱尿路上皮。 这三个组织的平均相对贡献率分别约为52％，32％和5％。虽然不同的患者尿液样本中cfDNA来源比例有很大差异，但排名顺序是一致的。与血液cfDNA检测相比，尿液cfDNA具有两个优点：首先，获取尿液比获取血液要容易和便宜得多，这使尿液成为资源有限环境下理想的生物液态样本。其次，尿液被认为是泌尿生殖道肿瘤早筛或监测复发的理想样本。 目前没有一个已注册的肿瘤IVD是完全基于检测尿液中cfDNA。其主要原因是因为保存尿液cfDNA的工作流程尚未标准化。其次，尿液中DNase I的活性比血清中高约100倍；因此，尿液cfDNA在体温下的半衰期约为2.6-5.1小时。
在临床上，终端用户收集样本过程中，稳定尿液cfDNA和防止有核细胞溶解至关重要。主要的方法有通过加入有色防腐剂（为其添加提供视觉参照），或通过容器内衬的干燥涂料以解决。一些解决该问题的产品已经进入市场。包括Urine Preservation (Norgen Biotek), Cell-Free DNA Urine Preserve (Streck), Quick-DNA Urine Kit (Zymo Research) 和NextCollect (Novogene) 。而用于研究用途的尿液cfDNA提取试剂盒，其cfDNA的产量因个体不同，显示出明显的差异。
由于分离尿液cfDNA仍然是一个技术上具有挑战性的问题，目前尿液中biomarker主要来源于尿液中的细胞。与血液相比，尿液标记物在检测或监测癌症方面的实际应用是有限的。其中主要的原因在于，相同的biomarker在不同的临床研究中得出的临界值或阈值往往不同。
3. 粪便
针对粪便的检测在肠道疾病中应用广泛，例如检测消化效率，肠道渗漏综合征，炎性肠病，营养不良，急性感染和CRC（Siddiqui et al.，2017）。 针对CRC的粪便检测产品已被广泛使用，常规的家庭式采集套件为样本采集提供了稳定且简便的采集方式。检测试剂盒中的稳定剂，有助于最大化保证粪便中的DNA质量。此外，样本处理过程中，需要去除粪便中的PCR抑制化合物。与总细菌DNA相比，粪便中来源人上皮细胞的DNA比例极小，因此基于PCR检测的诊断方法在这样的噪音背景下必须具有良好的顽健性。
4. 呼吸道样本
众多研究表明，呼吸源生物样本中可以检测到DNA甲基化，特别是痰、支气管肺泡灌洗、鼻腔冲洗/刷洗和呼出的呼气冷凝液等。毫无疑问，关于呼吸道样本中DNA甲基化的研究主要集中在肺相关疾病，如哮喘、囊性纤维化和肺癌等。通过影像学检查发现不确定的肺肿块后，第一步便是对痰进行细胞学分析，以检测肺癌相关细胞，此方法临床灵敏度为66%。高灵敏度的临床筛查，例如可疑肺结节的活检（90%的灵敏度），伴随高侵入性和高风险，有15%的机率导致肺塌陷（气胸）。为此，检测痰液中ctDNA甲基化具有极高的可行性。在肺癌队列研究中，通过对8个基因的甲基化水平的检测，可对肺癌的预测达到82-86%的准确度，阴性预测值（NPV）为88%到94%。另一项研究表明，利用痰液中TAC1、HOXA17和SOX17基因的甲基化水平检测肺癌的敏感性为93%。这些研究表明痰液中DNA甲基化检测的敏感性高于痰细胞检测。然而，由于目前并没有针对痰液采集和处理的标准化流程，因此检测分析前的变量仍然是临床转化的主要挑战。
支气管肺泡灌洗是支气管镜检后，用10-20 mL等渗盐水洗涤（灌洗）并收集以进行后续分析。 对于容易看见和可触及的中央病灶，需对病变区域进行镊取活检（敏感性74％），随后灌洗支气管肺泡（敏感性48％）。虽然支气管肺泡灌洗液通常用于细胞学分析，但也可针对灌洗液进行液体活检。在322例患者的灌洗液中，对SHOX2和RASSF1A基因启动子的甲基化进行检测，其对肺癌的检测灵敏度为81％。 其他研究也显示，基于对支气管肺泡灌洗液中PCDHGA12和SHOX2的甲基化检测，肺癌的检测敏感性分别为75％和78％，证明利用支气管肺泡灌洗液在肺癌检测中的价值。
呼出气冷凝物（EBC）的检测是一种新型的非侵入性肺癌检测方法。目前已有通过FDA认证的便携式EBC采集设备（Respiratory Research，Inc.的RTube™）。使用EBC采集进行检测，需要避免环境空气、唾液和鼻上皮的DNA污染。 此外，不同EBC收集方法的标准化也是一个众所周知的问题。 但与支气管肺泡灌洗相比，EBC的非侵入性使其成为更具有吸引力的生物样品。
四、 表观遗传IVD检测的临床实用性
长期以来，针对患者肿瘤组织的病理学分析一直是肿瘤分型和诊断的金标准。表观遗传学方法同样也可以利用这些组织样本，让新的分子诊断方法与传统技术并行进行。DNA甲基化检测不需要对肿瘤标本进行任何特殊处理，无论是对新鲜的、冷冻的，甚至福尔马林包埋的样本都具有同样的检测效率。实际上，DNA甲基化肿瘤学诊断领域的早期市场产品便是基于检测胶质母细胞瘤，前列腺癌和结肠直肠癌（CRC）的新鲜肿瘤活检或固定组织块中的特定基因的（例如基于MGMT，GSTP1和MLH1的检测方法）超甲基化。
DNA甲基化检测不仅限于组织样本，也可以拓展到多种体液样本（通常称为“液体活检”）。各种体液包含了大量与肿瘤发生、生长、免疫/癌症相互作用和细胞死亡有关的信息分子，同样也包含了循环肿瘤细胞（CTC）、微泡如外泌体等。在无法获得肿瘤组织的情况下，通过非侵入性或微创技术检测肿瘤相关信息元素，能够使得液体活检具有极高的应用价值。循环肿瘤DNA（ctDNA）是无细胞DNA（cfDNA）的肿瘤信息成分，可以为了解肿瘤变异和表观遗传特征提供窗口，并且比传统的组织活检方法具有多种优势。
现有的多数肿瘤筛查，基本是通过蛋白质免疫分析或成像技术进行诊断或监测。 例如许多国家已采用前列腺特异性抗原（PSA）监测作为对前列腺癌的人群筛查，以粪便潜血试验（FOBT）或改良的粪便免疫化学试验（FIT）进行CRC人群的筛查。尽管这些监测价格低廉，应用广泛，但仍没有一种监测可以为特定肿瘤类型的筛查或复发监测提供理想的检测性能，这为开发其他检测技术（例如DNA甲基化检测）提供了机会。在上述CRC的例子中，早期CRC可能由于肠道出血，向血液中释放少量ctDNA。FOBT或FIT主要检测粪便中由肠道出血导致的血红蛋白。目前有证据表明，基于粪便中的ctDNA检测比FOBT更可取（Schroy和Heeren，2005年），而基于血液中的ctDNA检测优于粪便检测（表1）。
表1：CRC临床早筛检测方法比较
简单的组织活检包含了复杂的细胞亚型，肿瘤内异质性/克隆性可能会对肿瘤真正的细胞组成提供误导性信息。最近的研究表明，ctDNA可以通过检测高比例的肿瘤细胞样本，更好地捕获肿瘤表观遗传变异信息。这归因于ctDNA的无偏性，暨所有细胞类型都可能对总DNA群体做出一定贡献。尽管许多已注册的检测产品（即获得FDA上市前批准（PMA）的测试，欧洲CE认证（CE-IVD）或通过CMS注册为实验室开发检测（LDT）的产品）都以ctDNA作为靶标（参见表2），但ctDNA不能解决目前的诊断缺陷。罕见肿瘤亚群中的ctDNA只能以很少的比例存在于cfDNA中，即使使用目前最敏感的技术也很难检测到。例如，BCAT1和IKZF1分别在97.8%和86.8%的大肠癌组织活检中表现高甲基化，而使用相同的检测方法检测ctDNA的能力却受疾病分期、肿瘤大小、位置和淋巴侵袭等因素影响。早期肿瘤血管生成不多，中心坏死较少，这可能是血液中ctDNA浓度较低的原因。为了提高ctDNA在临床中的精准度和实用性，除了选择优质的biomarker，提高检测技术的灵敏度之外，也可以同时筛选多种biomarker，通过将多种分析物检测模式结合到单个测试中，可以提高肿瘤检测的诊断能力。例如CancerSEEK，该检测结合了ctDNA测序和血清蛋白质biomarker的检测。
目前，至少有六个广泛的诊断领域可以将DNA甲基化肿瘤液体活检与传统的筛查和医学成像相结合，以提高患者的治疗效果：
1.初步诊断：确定可能患有肿瘤的个体，并通过传统的检测进行跟进筛查。
2.分诊：在不确定的影像学或活检结果后，进行进一步的检测以确定有创和/或无创筛查。
3.治疗选择：通过检测预后标记可将肿瘤分级，并辅助判断治疗方案：一线治疗或伴随诊断治疗，其中检测结果与特定治疗的疗效相关。
4.对治疗和治疗失败的反应：通过测量血液中ctDNA，以监测对治疗的初始反应；检测治疗后ctDNA特征，判断患者的耐药趋势。检测可以连续进行，以监测患者对治疗的反应趋势。
5.残留疾病监测：用于确定手术，辅助化疗或放疗后的小范围残留疾病，并确定患者的疾病复发风险。
6.复发：及早发现肿瘤复发风险，为目的性治疗提供更多机会。
展望未来，基于ctDNA甲基化检测技术的普适性、经济性和高通量性，甲基化biomarker在上述六个领域中持续发挥越发重要的作用。另外，在不可进行活检的情况下，例如在晚期转移性肿瘤期间，液体活检可以对病情进行连续监控，并对患者的影响最小。总体而言，从实用性和临床转化的角度来看，液体活检是一种极具吸引力的策略，能够在不久的将来极大地改变疾病的诊断和管理。
五、 产品市场契合度
随着慢性病，人口老龄化和国家医疗保健支出的增加，政府越来越关注每笔临床的投入成本。精准医疗在肿瘤领域的兴起为个性化治疗创造了机会。 21世纪的全球医疗保健的特点是循证医学，因此，在确定体外诊断（IVD）的市场价值时，需要向投资者和消费者提供充足的临床证据，暨价值与证据的质量成正比。
产品与市场的契合度的考量需要包含临床痛点、目标人群、消费群体。而产品本身需要考虑价格、检测周期、性能指标（如敏感性和特异性），以及运输物流等。例如，对于巨大潜在市场，如常见肿瘤早筛，需要考虑如何简化、排序和自动化体外诊断流程，以适应每年潜在增长的大量检测需求。2010年，在Epi-proclon发展的回顾（Payne，2010）中，Payne提供了一个关于表观遗传诊断的发展和临床转化的信息。根据Payne的经验，在产品开发的早期，必须考虑到检测的平台和自动化程度，并且检测应具备强大的性能，才能够在极高的非目标DNA背景下检测到微量的目标片段。
除去在技术上的不断完善，表观遗传IVD检测还必须具有极佳的时效性，以辅助临床诊断。如预后风险或生存率的预估，可以帮助临床制定不同等级的治疗方案。在预后情况较差的情况下，表观遗传IVD检测或在预测出转移性疾病复发的情况下，辅助临床判断是否需要加强对患者的监测。虽然最新的分子技术（如NGS）可以为表观遗传IVD检测的性能指标带来更大的优势，但对新技术和平台自动化的依赖，会极大提高产品的成本。昂贵的IVD检测需在使用场景上进行考虑，如在治疗费用高昂或重要的手术前后，产品会发挥更好的性价比。
而对于肿瘤早筛的IVD检测产品，其效用不仅应考虑在标准治疗中能检测到的肿瘤种类，而且还应考虑到患者和医疗报告中假阳性结果所形成的成本和风险。一般可以通过针对较高风险的亚群（例如吸烟的肺癌患者，或携带BRCA突变的卵巢癌患者）来提高真正的阳性率（称为阳性预测值（PPV））。但即便如此，也难以解决实际问题。如假阳性结果所导致的后续不必要的临床检测，和此过程中患者心理的伤害。例如，通过低剂量CT进行肺癌筛查，美国国家肺癌筛查试验（National Lung Screening Trial ）的结果显示，80.5％的无癌参与者经历了不必要的随访影像研究，其中2.2％的参与者进行了侵入性支气管镜检查，而1.3％的参与者则进行了没有必要的手术。另一项使用Cancer Antigen 125（CA-125）的筛查研究发现，在所用的卵巢癌和腹膜癌阳性筛查个体中，两名女性的结果为假阳性，并进行了手术，而手术并发症率为3.1％。
六、 表观遗传IVD检测中常用技术
概述
由悉尼CSIRO和Kanematsu实验室开发亚硫酸氢盐（Bisulfite）处理是检测DNA中5mC的金标准方法（Frommer et al.，1992；Clark et al.，1994）。在亚硫酸盐的处理后，5mC保持无变化的情况下，将单链DNA中的胞嘧啶残基（C）转化为尿嘧啶残基（U）。5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）主要局限于胚胎干细胞，并在一定程度上存在于大脑和肝脏细胞中，使用亚硫酸氢盐转换的方法并不能区分5mC和5hmC（Huang等人，2010）。目前，用于替代亚硫酸氢盐处理的方法是利用对DNA甲基化敏感（或特异）的酶，或者使用结合蛋白或抗体进行亲和捕获。亚硫酸氢盐处理可与多重探针检测相结合。选择性地检测DNA甲基化的方法常适合于液体活检，而预估CpG岛中DNA甲基化部分（通常称为β值）的方法更适合于组织检查。常用方法和分类见表3。
1. 亚硫酸氢盐处理
亚硫酸氢盐对目标DNA的处理并非毫无问题。DNA在强氧化的环境下，会导致大量的损失（Grunau等人，2001年）。这样的损失提高了对样本量的需求，从而降低了肿瘤检测的敏感性，特别是那些释放低水平ctDNA的癌症。此外，由于转换后的C碱基在基因组中大幅减少，致使基因组复杂度下降，形成假性三碱基基因组。并且在液体活检中（如ctDNA检测），需对PCR引物设计进行良好的打磨，以便在非靶点背景嘈杂的情况下，特异性地扩增极其微量目标片段。
亚硫酸氢盐处理后的DNA通常使用转化特异性PCR（CSP）或甲基化特异性PCR（MSP）引物进行扩增。对于CSP，不管甲基化状态如何，引物用来扩增亚硫酸氢盐转化的DNA；而对于MSP，引物针对的是未转化的C碱基，因此只能扩增具有甲基化的DNA。有时利用巢式PCR以增强亚硫酸氢盐处理过的DNA模版的扩增特异性。亚硫酸氢盐处理的DNA同样可与NGS结合使用。全甲基组可以通过全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）或CSP靶向扩增测序。启动子和CpG岛区域可以使用简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）等技术来进行检测，其中DNA被非甲基化敏感性限制性酶（识别CpG位点）消化，然后在亚硫酸氢盐转化之前进行基因片段选择。
MSP用于扩增癌症DNA中的超甲基化的启动子。在ctDNA检测中，与背景非靶DNA相比，来源于肿瘤的DNA很罕见，因此需要在ctDNA进行循环扩增之后，再进行PCR，检测结果仍具有很高的特异性。 MethyLight测定法是基于MSP的方法，添加了TaqMan荧光探针。该方法对低至0.01％的甲基化水平具有很高的敏感性，并具有良好的重复性。Quantitative Allele-Specific Real-time Target and Signal amplification（QuARTS）方法中同样利用包含5´DNA襟翼的探针，襟翼内切酶和荧光共振能量转移（FRET）化学试剂用于检测裂解产物。 HeavyMethyl方法是基于CSP的定量扩增，该方法利用寡核苷酸作为阻断剂，在引物位点与非甲基化DNA竞争结合，从而阻止了非甲基化DNA的有效扩增（Cottrell等，2004）。经亚硫酸氢盐处理的DNA的其他属性也可用于选择性扩增靶片段基因，例如利用变性温度可选择性扩增片段。该系列方法包括在较低变性温度共扩增PCR（COLD-PCR）（Milbury等，2011; Castellanos-Rizaldos等，2014）和亚硫酸氢盐差异变性PCR（Rand等，2006），其中的基本原理是在PCR中选择一个临界温度，以在甲基化DNA存在的情况下，选择性地变性未甲基化的基因组区域。甲基化敏感性高分辨率熔解（MS-HRM）方法是利用CSP反应后甲基化与未甲基化产物之间的熔解温度差异来量化甲基化。甲基化也可以使用PyroMark焦磷酸测序仪（Qiagen）或Epi光谱®质谱仪（Agena Biosciences）进行定量，这两种方法都可以检测到甲基化的微小变化。
2. 酶切
酶处理是亚硫酸氢盐处理的替代方法，优势是可以保证减少样本的损失，缺点是被检测的区域必须与目标基因座重叠，并且酶活性所导致的不完全的消化会混淆对结果的判断。 甲基化敏感性限制酶（MSRE）剪切处理可与定量PCR结合以评估DNA甲基化，更多的产物比例意味着扩增子内酶切位点有更高的甲基化修饰。相反，依赖于甲基化的酶，如GlaI，可用于选择性地剪切甲基化的DNA。 末端特异性PCR（ES-PCR）和辅助依赖性链反应（HDCR）技术便是通过对含有GlaI剪切末端的DNA进行选择性扩增。联合亚硫酸氢盐限制分析（COBRA）方法是将亚硫酸氢盐处理的DNA进行剪切后，在进行PCR扩增。
甲基化数字限制酶分析（DREAM）用于检测特定CpG位点的甲基化水平，暨限制性酶SmaI和XmaI识别序列5'-CCCGGG-3'。两种酶对CpG中心位点甲基化具有不同敏感性及不同的切割方式：SmaI的切割受到CpG中心位点甲基化的阻止，而XmaI的剪切不受CpG位点甲基化影响，因此，在两种酶同时作用下，甲基化位点即为未被SmaI切割的5'-CCCGGG位点。
3. 亲和捕获
亲和捕获技术是利用通常利用抗体免疫沉淀方法或甲基CpG结合域（MDB）蛋白，从DNA中富集甲基化DNA，该方法既可以检测5mC，也可检测5hmC。基因组DNA通过超声处理或酶消化，再进行捕获和纯化。洗脱后的DNA可构建文库，用于基因测序，也适合使用微阵列或基于PCR的方法进行分析。该方法的劣势在于，操作中不同的方法，容易导致DNA甲基化富集分布的模式大相径庭。另一种常用的亲和捕获技术是在亚硫酸氢盐处理的剪切或消化的基因组DNA片段的扩增过程中，加入生物素化的胞嘧啶，然后使用链霉亲和素偶联的磁珠进行亲和捕获。
4. 多探针的检测
Infinium甲基化检测利用两个位点特异性探针的单碱基延伸来检测CpG二核苷酸处的胞嘧啶甲基化，每个探针分别针对亚硫酸氢盐转化的基因组DNA的甲基化和非甲基化基因位点。可以通过计算来自甲基化位点与未甲基化位点的荧光信号之比来确定被检测位点的甲基化水平。这是迄今为止使用最广泛的“全基因组” DNA甲基化分析平台，有大量可用的公共数据。该平台的生物信息学分析途径也已经成熟。该平台当前可用的第三次迭代是Infinium MethylationEPIC BeadChip，它可以查询863,904个CpG位点。 另外一种检测技术BSPP（Bisulfite padlock probes）通过目标区域DNA设计两条反向互补探针，分别跟检测靶基因两端杂交，并通过已知连接序列（linker）将两条探针连接，可与DNA靶杂交形成环状（Nilsson等，1994）。 分子倒置探针（MIP）是BSPP探针的衍生物，它在靶序列DNA中含有缺口，因此更加灵活。 这些探针可用于各种形式的基因组分析，SNP基因分型或拷贝数变异检测。BSPP主要适用于分析DNA甲基化（Ball等，2009; Deng等，2009; Diep等，2012），其特定设计探针与亚硫酸氢盐处理的DNA杂交，通过高通量测序方法进行检测。
在后续的报道中，我们将对表1中的产品进行详细的介绍。
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