标题：Regulation of telomere homeostasis and genomic stability in cancer by N6 -adenosine methylation (m6A)
期刊：SCIENCE ADVANCES
IF: 14.136
发表时间：2021.7.28
技术平台：m6A-seq，RNA-seq、ChIP-seq
技术亮点：m6A
m 6 A甲基化修饰是真核生物mRNA甚至病毒RNA广泛存在的一种RNA修饰形式。m 6 A修饰早在上世纪70年代就已经被报道，但对该修饰在RNA中的整体分布以及其对基因表达调控的影响一直以来却知之甚少。2011年，第一个真正意义上的RNA去甲基化酶FTO的报道，使得mRNA/lncRNA的甲基化研究再次进入人们的视野。MeRIP通过m 6 A特异性抗体富集和测序，用于研究RNA的腺苷甲基化修饰。易基因自主研发微量RNA甲基化检测技术，样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需5μg总RNA。
研究背景：
RNA甲基化在癌症中的作用已在众多研究中被确认，而m6A是mRNA上最丰富的内部修饰。人们普遍认为m6A修饰在mRNA生命周期的几乎每个方面都发挥着重要作用，m6A 修饰调节 mRNA 的稳定性、剪接、转运、定位和翻译。m6A由甲基转移酶复合体（METTL3、METTL14、WTAP）、去甲基转移酶（FTO、ALKBH5）、结合蛋白（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2）等协同调控，其中METTL3是影响m6A修饰水平至关重要的酶。一旦m6A机制改变，可能导致癌症不受控制的增值、分化、转移和耐药等。然而这种表观转录组学标记在人类癌症中的作用仅在有限的癌症类型中有过研究，其潜在机制仍不清楚。另外，尚不清楚特定靶基因m6A水平异常是否会直接导致癌症发展。此外，m6A信号改变通常在癌细胞培养中表征，但在人体癌组织中还没有得到证实。因此临床样本的确认将有助于阐明和证实表观转录组学在癌症中的作用。
研究结果：
1、m6A修饰和RNA甲基转移酶 METTL3 在多种癌症类型中均上调
为了充分阐明由METTL3催化的m6A 修饰在癌症中的作用，作者首先检测了几种不同类型癌细胞和对应正常细胞在核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）缺失状态下RNA中m6A的丰度（图1A）。结果显示癌细胞系中m6A总体水平显著上调，在所有受试细胞系中，METTL3的表达模式与m6A总体水平相似（图1B），表明m6A修饰失调在癌症中普遍存在，可能主要归因于METTL3的异常表达。
为了证实这一结果，研究人员从原发性前列腺癌患者中收集了12对癌组织和肿瘤邻近正常组织样本，并量化临床样本中的m6A总体水平（图1C）及METTL3表达（图1D）。结果显示与对应的正常组织相比，前列腺癌中m6A水平和METTL3表达均显著上调。检测到METTL3的特异性核染色（图1E），其在癌症样本中显示的信号分布远强于癌症邻近正常组织（图1F）。免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）分析检测到 METTL3 的特异性核染色（图1E），且在癌组织样本中的显示强度远高于肿瘤邻近正常组织（图1F）。另外，在癌症基因组图谱（TCGA）数据和肝癌、肺癌患者的单独队列中，METTL3表达均呈上调现象。这些结果表明，RNA甲基转移酶METTL3及m6A修饰在人类癌症中均异常上调。
图1
2、HMBOX1是癌细胞中m6A修饰的真正靶点
为了解METTL3催化m6A修饰的致癌机制，作者使用RNA甲基化测序（MeRIP/m6A-seq）绘制了良性永生化前列腺上皮细胞RWPE-1和前列腺癌细胞LNCaP中的m6A图谱。根据两个细胞系m6A水平分布，将MeRIP/m6A序列中所有m6A修饰位点分为三个簇（图2A）。在
敲除METTL3后在LNCaP细胞系中进行基因表达谱分析，以此确定差异表达基因列表（图2B）。将RNA-seq测序中确定的METTL3依赖基因与MeRIP/m6A-seq中LNCaP簇的基因重叠，从而产生323个m6A在癌症中潜在靶点的转录本（图2C）。通过检测这323个候选靶点在活性和非活性METTL3基因中的表达变化，揭示了端粒酶-染色质结合和维持端粒长度所必需的蛋白质HMBOX1（homeobox containing 1）在活性和非活性METTL3基因中的差异表达相反（图2D）。
在MeRIP/m6A-seq数据中，前列腺癌细胞LNCaP中HMBOX1的3′UTR区m6A峰比正常上皮细胞RWPE-1更强（图2E）。与此同时，在肝癌细胞Huh-7和HepG2、肺癌细胞A549等其他几种上皮癌细胞系中，同样的区域也发生了甲基化。结果证实了与正常细胞免疫球蛋白G（IgG）水平下降相比，HMBOX1转录物在m6A特异性抗体的免疫沉淀中富集，当METTL3在LNCaP、Huh-7或A549细胞中表达沉默时，IgG水平下降程度减少（图2F）。当METTL3在肝癌细胞系Huh-7（图2G）和肺癌细胞系A549（图2H）中被敲除时，HMBOX1则显著上调。在异种移植肿瘤中，HMBOX1的mRNA水平（图2I）和蛋白质（图2J）水平显著升高，这与体外数据研究结果一致。因此可以得出结论：HMBOX1是几种类型癌症中m6A修饰机制的真正靶点。
图2
3、TYTHDF2与HMBOX1 mRNA的m6A修饰结合促进癌细胞中的mRNA降解
研究人员发现，当LNCaP细胞中METTL3表达沉默时，HMBOX1中的成熟mRNA水平明显上升，而前体mRNA（pre-mRNA）几乎没有变化（图3A）。使用转录抑制剂放线菌素D（ActD）处理LNCaP细胞，并比较正常细胞和METTL3或ALKBH5敲除时HMBOX1 mRNA的半衰期，结果发现当METTL3表达沉默时，HMBOX1 mRNA水平稳定，而ALKBH5的敲除则加快HMBOX1 mRNA衰减速率（图3C）。表明HMBOX1前体mRNA的降解不受METTL3基因敲除的影响。
最近的研究表明，两种包含YTH结构域的m6A识别蛋白YTHDC2和YTHDF2促进了mRNA修饰的降解。研究人员敲除YTHDF2时，HMBOX1的mRNA和蛋白质水平都显著增加（图3D，E），敲除YTHDC2对HMBOX1表达的影响非常小。这些结果表明YTHDF2在HMBOX1 mRNA的m6A依赖性衰变中起着关键作用。接下来研究人员对LNCaP中的MeRIP/m6A序列数据进行甲基化（图3F），并使用基于CRISPR-Cas9的m6A编辑工具进行分析，结果证明了m6A修饰是导致癌细胞中HMBOX1转录物衰减的执行因子（图3G,H,I）。
图3
4、METTL3诱导的HMBOX1降解导致癌细胞端粒功能障碍
HMBOX1此前已被证明可调节各种类型肿瘤细胞的端粒长度，因此本研究想验证癌细胞的端粒长度是否由METTL3-HMBOX1轴控制。研究人员通过定量聚合酶链反应（qPCR）检测早期传代和晚期传代细胞的平均端粒长度，并以人类基因组中的单拷贝基因HBG作为数据标准化的参考，结果在LNCaP细胞（图4A）和A549 细胞（图4B）中都发现METTL3过表达细胞中的端粒长度相对比正常细胞短，HMBOX1同时过表达后METTL3对维持端粒长度的抑制作用降低。无论METTL3单独表达还是与HMBOX1共表达，通过荧光原位杂交（FISH）分析表达METTL3的晚期传代A549细胞的中期染色体扩散，端粒长度的变化都可以看到（图4C）。定量分析证实，与正常细胞或HMBOX1共表达细胞相比，METTL3过表达细胞的端粒侵蚀或丢失更为普遍（图4D）。所有数据表明，由于逆转录酶活性和核糖核蛋白酶复合体关键成分水平的调节，METTL3-HMBOX1 轴不太可能调节端粒长度。
当敲除HMBOX1时，端粒结合蛋白TPP1和端粒酶逆转录酶TERT之间的相互作用明显中断（图4E），METTL3过表达细胞的免疫沉淀物中的TERT可以通过重新引入 HMBOX1 来恢复（图4F）。为观察METTL3-HMBOX1轴对端粒酶复合物和端粒之间关联的影响，研究人员对METTL3过表达的LNCaP细胞进行内源性端粒酶RNA基因（TERC）RNA-FISH检测和抗TRF2抗体免疫染色，无论有或没有HMBOX1共表达（图4G）。同时在正常RWPE-1细胞中进行同样的分析。分析数据证实了功能性端粒酶复合物在癌细胞中重组，促进恶化。
接下来，研究人员使用核糖核酸酶（RNase）-缺陷型Cas13b（dCas13b）建立了另一个可编程的m6A编辑平台，所有的数据都支持m6A修饰HMBOX1需要完整的METTL3活性，足以降低HMBOX1的表达并阻止端粒酶加载到端粒上。数据表明，METTL3过表达会干扰端粒酶复合物的正常募集，从而导致癌细胞中端粒的逐渐丢失，而端粒酶复合物是通过m6A诱导的HMBOX1下调引起的（图4H,I,J）。最后，研究人员证明了METTL3-HMBOX1轴调节癌细胞中端粒酶的端粒募集和端粒长度，从而导致DNA损伤反应的参与（图4K,L）。
图4
5、METTL3过表达使p53通路失活并通过HMBOX1甲基化在癌细胞中造成染色体不稳定性
由功能失调的端粒诱导的DNA损伤可能导致基因组不稳定（癌症标志），也可能通过靶向DNA修复机制诱导细胞死亡，两种不同结果取决于p53信号通路的状态。因此研究人员首先检测了METTL3单独或与HMBOX1共同过表达的LNCaP细胞中p53的活性（图5A）。结果表明METTL3过表达使p53通路失活，而HMBOX1的重新引入完全消除了METTL3对p53信号通路的抑制作用。在肺癌细胞A549中得到了类似的结果（图5B）。当HMBOX1在细胞中同时过表达时，p53 蛋白的主要负调节因子MDM2被METTL3显著上调并恢复到正常水平（图5C）。
根据这一结果和此前在慢性粒细胞白血病细胞K562中发表的HMBOX1染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据，研究人员推测MDM2是在癌细胞中被HMBOX1转录抑制的直接靶基因。为验证HMBOX1上的m6A修饰参与MDM2表达的调节，在基于dCas13b 的m6A编辑平台中检查了MDM2基因的前体mRNA和成熟mRNA水平，结果强有力的证明了HMBOX1上METTL3催化的甲基化破坏了MDM2的转录抑制，最终导致p53信号通路失活（图5D,E,F,G），且HMBOX1 可直接抑制MDM2基因的转录，MDM2基因通过METTL3催化的HMBOX1上的m6A修饰被抑制。
接下来研究人员通过染色质定位荧光原位杂交（CO-FISH）技术分析在癌细胞中METTL3过表达（单独或与HMBOX1共表达）时，是否存在端粒相关的染色体畸变。数据结果表明METTL3-HMBOX1轴是癌细胞基因组完整性的决定因素，并且这种特定的表观转录失调将促进染色体不稳定性，从而促进肿瘤进展（图5H,I,J,K）。
图5
6、METTL3诱导的基因组不稳定性导致癌细胞恶性进展，HMBOX1可以缓解这种进展
基于METTL3-HMBOX1 轴在调节基因组稳定性中的作用，METTL3过表达加速了前列腺癌细胞LNCaP、肝癌细胞Huh-7和肺癌细胞A549的致癌潜能，而这种致癌潜能被HMBOX1的共表达中断（图6A）。此外，METTL3过表达显著增强了LNCaP细胞的转移（图6B）和侵袭（图6C）能力，当HMBOX1重新引入细胞时，由METTL3过表达驱动的侵袭性癌细胞被明显抑制。研究人员在A549中获得了类似的结果（图6D,E）。结果表明HMBOX1可以防止METTL3诱导的癌症恶性进展。
图6
7、METTL3-HMBOX1轴失调与癌症中端粒缩短和基因组不稳定性相关
与METTL3过表达相反，HMBOX1在TCGA数据中显著下调（图7A），这在前列腺癌（图7B）、肝癌（图7C）和肺癌（图7D）等各癌症类型患者中的独立基因表达谱中得到进一步证实，所有数据表明HMBOX1在癌症中异常下调。
为验证细胞培养中的m6A模式是否在人体组织中一致，研究人员在12对原发性前列腺癌组织和正常邻近组织中始终发现前列腺癌中HMBOX1的m6A修饰水平（图7E）和mRNA表达水平（图7F）低于正常组织。m6A水平与METTL3表达正相关，但与HMBOX1表达负相关（图7G）。这些结果共同支持HMBOX1高度甲基化，这可能导致HMBOX1在癌症中下调。
最后，研究人员将前列腺癌组织中的端粒长度与METTL3或HMBOX1的表达相关联（图7H），并对人类癌症基因组变化进行类似的相关分析，结果发现在TCGA数据集中，METTL3 的mRNA表达水平与HMBOX1表达呈负相关，但与部分基因组异常变化呈正相关，两者均具有统计学意义（图7I），这种相关性在肝癌（图7J）和肺癌（图7K）中同样被观察到。所有数据结果都表明METTL3催化的m6A对某些转录物（如HMBOX1）修饰在基因组不稳定性方面起着非常重要的的作用，这是大多数癌细胞的共同特征。
图7
易基因小结
在这项研究中，作者阐明了表观转录组标记 m 6 A在控制癌细胞中端粒稳态和基因组稳定性中的新作用。得出以下结论：
（1）m6A修饰和RNA甲基转移酶 METTL3 在多种癌症类型中均上调；
（2）HMBOX1是癌细胞中m6A修饰的真正靶点；
（3）YTHDF2结合m6A修饰促进癌细胞中的HMBOX1 mRNA降解；
（4）METTL3诱导的HMBOX1降解导致癌细胞端粒功能障碍；
（5）METTL3过表达使p53通路失活并通过HMBOX1甲基化在癌细胞中造成染色体不稳定性；
（6）METTL3诱导的基因组不稳定性导致癌细胞恶性进展，HMBOX1可以缓解这种进展；
（7）METTL3-HMBOX1轴失调与癌症中端粒缩短和基因组不稳定性相关。
作者通过m6A-seq和RNA-seq、ChIP-seq等多组学测序分析，揭示了癌症驱动的基因组改变可能可以通过纠正特定的表观转录组调控来修复，这为癌症治疗提供了一种新方向。
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文献来源：10.1126/sciadv.abg7073 扫码获英文版全文
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