《Cell Reports Medicine》杂志2023年2月在线发表复旦大学附属华山医院神经外科/国家神经疾病医学中心的Qilin Zhang（张启麟）、 Boyuan Yao,、 Xin Long等撰写的《单细胞测序识别对PitNET分子分类和预测复发的与分化相关标志物Single-cell sequencing identifies differentiation-related markers for molecular classification and recurrence prediction of PitNET》（10.1016/j.xcrm.2023.100934）。
垂体神经内分泌肿瘤(PitNET)是最常见的颅内肿瘤之一，其复发率多变。目前，对复发的预测并不令人满意，可以通过了解细胞起源和分化状态加以提高。为了全面揭示PitNET的起源，我们对3个垂体前叶和21个PitNET的单细胞RNA测序数据进行了对比分析。我们在每个谱系中确定了代表高分化和低分化PitNETs主要亚型的不同基因。为了进一步验证分化生物标志物的预测价值，我们纳入了一个包含800例患者的独立队列，平均随访7.2年。在PIT1和TPIT谱系中，低分化组的复发率显著高于高分化组的，而在SF1谱系中，高分化组的复发率显著高于低分化组的。我们的研究揭示了PitNET可能的起源和分化状态，并据此提出了新的分化分类，并验证了其预测肿瘤复发的能力。
重点
✱APG的轨迹分析揭示了PIT1祖细胞谱系簇
✱通过对比分析，评价了PitNET的分化状况
✱与分化相关标志物有助于预测远期复发
引言
垂体神经内分泌瘤(PitNET)是最常见的颅内肿瘤之一，患病率为14% - 22% 。PitNET起源于垂体前叶(APG), APG分泌六种激素:泌乳素(PRL)、生长激素(GH)、促甲状腺激素(TSH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)(图S1A)。PitNET因激素分泌过多和局部侵袭周围结构而表现出一系列临床表现。根据2022年WHO最新标准，目前PitNET的病理分类是基于组织学激素染色和三种谱系特异性转录因子(TFs)的表达，包括PIT1(也称为POU1F1)、TPIT(也称为TBX19)和SF1(也称为NR5A1)。临床上应用最广泛的分类是结合了3种转录因子的免疫组织化学(IHC)和血清激素水平的临床病理分类。临床病理分类将PitNETs分为PIT1谱系(泌乳素细胞、生长激素细胞、促甲状腺激素细胞和静默性PIT1肿瘤)、TPIT谱系(促肾上腺皮质激素细胞和静默性TPIT肿瘤)、SF1谱系(促性腺激素细胞和静默性SF1肿瘤)、零细胞瘤和多激素肿瘤。其中，无激素分泌型PitNETs分为静默性PIT1、静默性TPIT、静默性SF1的PitNETs，或基于三种TFs表达的零细胞瘤。目前PitNET的临床病理分类见图S1B。
对PitNET的主要治疗方法包括手术、药物治疗和放疗。尽管近年来取得了很大进展，但复发，尤其是远期复发率(10% - 30%)仍是临床面临的一大挑战。复发肿瘤的完全切除率明显较低，通常会导致视力障碍和垂体功能减退，需要终身激素替代治疗。对于复发风险较高的患者，应密切随访并及时干预。因此，准确预测复发对PitNET个体化治疗至关重要。
然而，目前的临床病理分型并不能满足上述需求，仅包含几个复发的危险因素，包括高Ki-67指数、男性的泌乳激素腺瘤、静默性促肾上腺皮质激素小细胞腺瘤和Crooke细胞腺瘤,目前仍缺乏能够准确预测肿瘤复发的特异性分子标志物。了解肿瘤细胞的起源和分化状态是扩大和细化现有肿瘤分类的基础，可能提高其预测肿瘤复发的能力。
单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术最近的快速进展为全面了解异质性肿瘤的细胞成分和调控网络提供了机会.例如，通过对神经嵴源性神经母细胞瘤(NB)和胎儿肾上腺的scRNA-seq数据的比较分析，NB的肿瘤起源被定位到去甲肾上腺素能嗜铬细胞，其中增殖/分化状态对NB有重要的预后影响。考虑到谱系和激素产生细胞的多样性，APG和PitNET是scRNA-seq技术探索肿瘤起源和分化状态的理想对象。一些出版物已经报道了小鼠垂体、大鼠垂体、人胎儿垂体和人垂体细胞的scRNA-seq 。后来的研究是在存档的冷冻垂体组织上进行的，因此是单细胞分辨率的，而新鲜成人APG的数据有限。对于肿瘤，一项研究显示了来自3个PitNETs谱系的2311个细胞的单细胞标志物的逆转录测序数据，揭示了一些新的肿瘤相关基因和肿瘤内异质性。另外两项由Zhang等人进行的scRNA-seq研究分别专注于ACTH和静默TPIT PitNETs的分泌和侵袭机制。最近发表的一篇文章详细阐述了ACTH PitNETs中逃避凋亡的机制。尽管有这些研究，结合APG和PitNET数据的深入探索在单细胞分辨率下确定肿瘤的起源和分化状态仍然是非常必要的。因此，我们首先对三个成人APG进行了scRNA-seq，并建立了单细胞分辨率下的转录谱。然后，我们利用这一独特的资源鉴定了21个PitNETs的转录特征和可能的来源，并利用这些数据对其分化状态进行了分类。在一个包含800个肿瘤的独立队列中，利用PitNET在每个分化状态中发现的新分子标志物预测肿瘤复发，平均随访时间为7.2年。
讨论：
PitNET是最常见的神经内分泌肿瘤，具有高度的肿瘤异质性和多样的临床表现。目前，肿瘤复发的预测是一个巨大的挑战，因为目前的分类系统预测价值有限。在本研究中，我们在单细胞分辨率下对正常成人APG和PitNET进行了对比分析，并评估了PitNET的分化状态(图7)。然后，我们在当前临床病理分类的三个主要谱系中展开了单细胞转录组标签。ENPP1、NTS、GATA3、IGFBP7和LRRC4C是PIT1谱系的特异性标志物;ID4和CITED1是TPIT谱系的特异性标志物;FSHB是SF1谱系的特异性标志物。利用新的转录组标签和标志物来扩展目前的分类是本研究的主要科学创新，这可能会促进其临床转化和应用。
此外，根据PitNETs肿瘤细胞的分化状态，提出了一种新的分化分类:高分化组和低分化组。在另一个包含800例患者(中位随访时间为7.2年)的大型队列中，我们验证了从两个分化组中发现的这些标志物。低分化组PIT1和TPIT谱系复发率均显著高于高分化组的，而高分化组SF1谱系复发率显著高于低分化组的。总之，这些证明了新的分化分类在复发预测中的潜在应用。
此外，新的分化分类还可以对Ki-67指数的预测能力进行分层，Ki-67指数是一种广泛用于预测肿瘤复发的增殖标志物。我们发现，在高分化PIT1 PitNETs中，Ki-67对肿瘤复发具有良好的预测价值，而在低分化PIT1、TPIT或SF1 PitNETs中，对肿瘤复发的预测价值有限。这可能解释了在促性腺激素肿瘤和无功能垂体腺瘤中Ki-67预测价值的矛盾结果。总之，本研究的临床创新之处是建立了一种新的分化分类，可以通过特定的分子标志物精确预测肿瘤复发，这可能有助于制定个体化的随访策略。
我们揭示了APG的发育轨迹，并确定了一个名为Pro.PIT1的簇。将我们的成人APG数据与胎儿APG数据合并后，我们发现大量胎儿PIT1细胞处于低分化状态，与Pro细胞相似。成人APG中的PIT1细胞。特别是，胎儿细胞中的大多数泌乳素细胞不成熟，提示这一类型细胞的出生后的发育。
对于TPIT和SF1谱系，成人APG的细胞与相应的胎儿APG细胞相似，而这两个谱系的祖细胞在本研究中未被识别。我们推测这两种谱系的祖细胞可能位于边缘带或Rathke裂的残端。另一项包括所有垂体组织(前叶、Rathke囊和后叶)的scRNA-seq研究应经过处理以进一步了解成人垂体的异质性。
我们聚焦关注750个表达SOX2的细胞(296个来自APGs和454个来自PitNETs)，发现与EMT相关通路的激活在个体中是共享的，并且随着分化程度的增加而减少。我们还识别并验证了大多数SOX2表达细胞共有的几个细胞表面标志物(如CLDN4)，这些标志物可用于流式分选(flow sorting)。有趣的是，我们发现PitNETs中的大多数TSCs不增殖。另一方面，一项体外研究提示，分离出的PitNET TSCs可以生长为球体。这些结果表明TSCs在体内处于非增殖状态，具有增殖和分化的潜能。
通过比较PitNETs和APGs，我们估计了每个肿瘤簇可能的细胞起源和分化状态。分化良好的PitNETs显示出激素生物合成和分泌相关通路的激活。另一方面，大多数低分化PitNETs是静默性肿瘤，并表现出与代谢（尤其是脂质代谢）相关通路的上调。出现这种模式的原因可能是这些亚型的高度增殖性，以及与有丝分裂相关的多个过程(如细胞膜合成和细胞内信号转导)需要脂质代谢物。Neou等发表的134个PitNETs的队列研究也验证了高分化PitNET和低分化PitNET的分子特征。这些特征性改变可能为这些高度复发的PitNET亚型未来的治疗靶点探索和药物开发提供思路。
值得注意的是，我们测序了一个罕见的肿瘤共表达SOX2和PAX7，表明它的低分化状态。该患者复发迅速，对治疗的应答不佳(图S10)。这些特征支持了评估肿瘤分化状态的重要性，尤其是对于临床侵袭性肿瘤。应进一步研究积累更多的低分化肿瘤病例，重点关注其临床特征、分子特征和高增殖机制，以明确这一新型亚型的预后价值，并提供新的治疗靶点。
本研究的局限性
本研究仍存在一定的局限性。首先，死亡可能对APG细胞的转录组程序产生潜在影响，导致未知的数据偏倚。其次，每个亚型的PitNETs数量仍然有限。需要更多的研究，包括更多的样本和他们的数据整合，以获得更深入的见解。第三，虽然我们的研究通过比较分析推断了PitNET的可能起源，但仍需要对PitNET模型进行谱系追踪确认研究来确认所研究的PitNET的起源。
综上所述，我们揭示了三个成人APG和21个PitNET肿瘤的单细胞转录组学特征，并估计了每个PitNET的分化状态。我们进一步发现，不同分化状态的标志物有助于预测PitNETs的复发。
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