PCR技术介绍--DNA聚合酶
TaqDNA聚合酶
在早期进行的PCR反应中，使用的是大肠杆菌DNA聚合酶1的大片段，，即Klenow片段。也曾有人用噬菌体T4 DNA聚合酶。这两种酶的共同弱点是对热不稳定性，DNA合成反应只能在370C进行。PCR时每一循环的解链温度都在90C以上进行，故在每两个循环之间要加入新的DNA聚合酶，使得整过程整个实验过程很繁琐和昂贵。同时在370C，引物与DNA模板之间会发生分子非特异性结合，最终导致很多非特异性DNA片段的扩增。
Taq 酶有耐高温的特性，其最适的活性温度是720C（75-80），连续保温30分钟仍具有相当的活性，而且在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA合成的能力，一次加酶即可满足PCR操作过程自动化的实现。
Taq 酶在 PCR 反应中所起的作用是利用其 3′→ 5′聚合酶活性以 DNA 为模板，将 dNTP 中的脱氧单核苷酸逐个加到 3-OH 末端；同时利用其 5′→ 3′外切酶活性即能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关，又可以从5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。由此在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断，故可进行定性与定量检测。
Taq酶由水栖高温菌（Thermus aquatics）YT1蓖株中分离而得。此菌于1969年由Brock分离自美国黄石公园温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为70～75，有实验表明 Taq 酶活性在热启动以后的半衰期为：97时 20 分钟、95时 40 分钟、94时 60 分钟、92时 90 分钟。半衰期后 PCR 扩增效率迅速降低为接近零。
TaqDNA聚合酶的热稳定性及最适延伸温度
相对分子质量为94000的TaqDNA聚合酶的酶活性较高，大约为200000Umg，在合成时有一个较高的最适温度75-80C，转换数Kcat接近150nt/(s·酶分子)。这种活性有明显的温度依赖性。TaqDNA聚合酶虽然在90C以上合成DNA的能力有限，但高温时仍比较稳定。有人试验证明在92.5C,95C,和97.5C时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130分钟、40分钟和5-6分钟后仍可保持50%左右的活性，其半衰期较长。所以，在一个PCR预备试验中，每次循环时上限温度为95C（试管内）处理20秒，则循环50次后TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能够保证实验的需要。
TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其最适延伸温度在75-80C时，dNTP的掺入速度为35-100nt/(·酶分子),最长延伸长度7。6kb，如对M13上的富含GC的30-me引物，该酶在70C的延伸率高于60nt/(·酶分子),在55C仍有较高的延伸活性，22C和37C时延伸速度分别为0。25和1。5 nt/(·酶分子)。由此可见，在低温下，TaqDNA聚合酶一表现活性明显降低，因而，导致此酶在模板链分子内局部二级结构区域的延伸能力受损或前进速率常数与解离常数的比值发生改变。在很高的温度（90C以上）时，很少DNA合成。在体外条件下，DNA在较高温度时的合成速度受到引物或引物链与模板链的双链结构稳定性的限制。温度对TaqDNA聚合酶活性的影响见表。
由于TaqDNA聚合酶的最适延伸温度高达75-80C，故退火和延伸反应温度均可提高，限制了非特异性扩增产物的出现，增加了PCR的特异性。
如何选择DNA聚合酶？
在选择之前，先了解一下DNA聚合酶的四个重要特点：热稳定性，保真度，扩增速度及特异性。
l 热稳定性
热稳定性是指DNA聚合酶能够耐受高温的能力。不同的DNA聚合酶的热稳定性差异较大，一般通过半衰期来体现。
l 保真度
保真度是指DNA聚合酶精确复制DNA模板的能力。部分DNA聚合酶具有3’-5’的核酸外切酶活性，能够校正错误碱基。保真度的高低可通过错配率来体现。
l 扩增速度
扩增速度是指在延伸时，DNA聚合酶向DNA新链中掺入核苷酸的速率。扩增速度除与DNA聚合酶有关，还会受到延伸温度，缓冲液及模板复杂程度等的影响。
l 特异性
特异性是指DNA聚合酶在PCR过程中只扩增目的片段的能力。为了提高PCR特异性，常通过抗体法或配体法等方式对DNA聚合酶进行修饰，使酶活性在低温条件下封闭，减少非特异性延伸和扩增。
常见的DNA聚合酶
1）Taq DNA聚合酶（应用：常规PCR。）
Taq DNA聚合酶来源于Thermus aquaticus，热稳定性高，在PCR循环高温条件下仍可保持较高的酶活。Taq DNA聚合酶具有良好的行进性，扩增效率高，扩增速度为30-60 sec/kb。但该酶无3’→5’核酸外切酶活性，即无校正功能，易产生错配碱基。使用该酶扩增得到的PCR产物3’末端带A，可直接用于TA克隆。
2）高保真DNA聚合酶（应用：高保真PCR，如基因克隆、点突变、测序及SNP分析等。）
高保真DNA聚合酶是一类具有3’→5’核酸外切酶活性的酶，具有校正功能，扩增产物为平末端。当实验对保真度要求较高时，需选择此类酶。常见的高保真酶有Pfu、KOD、Phusion、Canace等。不同的高保真酶在保真度，扩增速度，扩增效率等方面有所差异。一代的高保真酶的保真度较低，扩增速度较慢，如Pfu，KOD等。
3）热启动DNA聚合酶（应用：低拷贝基因扩增。）
热启动DNA聚合酶是一类提高PCR产物特异性的酶。该类酶是通过抗体法或配体法等方式对DNA聚合酶进行修饰而成，使得DNA聚合酶活性在预变性温度下才被激活。
4）Taq Plus DNA聚合酶（ 应用：快速、常规PCR。）
Taq Plus DNA聚合酶是由Taq DNA聚合酶和具有3’→5’核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶按比例混合而成，具有扩增效率高和错配率低的优良性能，其扩增速度为30 sec/kb，错配率是Taq DNA聚合酶的1/6。使用该酶扩增得到的PCR产物3’末端带A，可直接用于TA克隆。
5）Long Taq DNA聚合酶（应用：长片段PCR。）
Long Taq DNA聚合酶也是Taq 酶与高保真酶按比例混合而成的酶，配上优化的缓冲体系可使得该酶可扩增长达8 kb的人基因组DNA片段和10 kb的质粒模板。其PCR产物3’末端带A，可直接用于TA克隆。
6）直接扩增DNA聚合酶（应用：转基因型鉴定，基因分型）
直接扩增DNA聚合酶是指可以直接以样本裂解产物或未纯化的基因组DNA为模板进行扩增的酶。该类酶具有很强的PCR反应抑制物耐受性。
DNA聚合酶分为常温酶和PCR酶。
常温酶有大肠杆菌DNA 聚合酶I 、T4 DNA聚合酶等。大肠杆菌DNA 聚合酶I 经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为76KD，通常称为Klenow fragment，小片段的分子量为34KD，称为Klenow (3’-5’ exo-) 。在NGS文库构建时，通常用Klenow fragment和T4 DNA聚合酶组合进行片段化后的DNA末端修饰。当然，如果是物理打断，末修体系中还要加入PNK修复断裂的磷酸基团。采用one-tube的建库方法，直接在体系加入taq DNA聚合酶一步完成末修加A，三步法则需要纯化，用Klenow (3’-5’ exo-)加A。
phi29 DNA聚合酶也是NGS用的较多，在单细胞基因组扩增中早期都是用它，无论是MDA、还是谢晓亮老师的MALBAC的方法。直到2017年，谢晓亮组发表的LIANTI方法，才替换了这个酶，用的是带T7启动子的Tn5转座子打断，然后用T7启动子体外线性扩增。
还有其它不同DNA聚合酶也有使用，比如Bst聚合酶，该酶具有很强的链置换能力，最适温度是65°C，常用于LAMP检测（环介导等温扩增反应）。而且，llumina测序仪在X Ten使用RPA技术之前，簇生成技术用的桥式PCR就是交替使用Bst聚合酶进行延伸反应以及使用甲酰胺（formamide）进行变性反应。
当然最重要还是PCR酶。PCR酶是耐热DNA聚合酶，分为两种普通耐热DNA聚合酶，以Taq酶为代表，PCR产物有A尾；高保真DNA聚合酶，以pfu DNA 聚合酶和KOD为代表。高保真的DNA聚合酶具有3'-5'外切酶活性可以消除错配，PCR产物为平末端。
目前NGS文库构建，即使普通的高保真DNA聚合酶都很少使用。因为在文库覆盖度、模板偏好性、GC bias等NGS文库对PCR酶有着最高要求，若非经过千锤百炼的酶难以胜任。
当然，分子生物学的发展，也包含着PCR酶的发展：
1973年，台湾科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年PCR技术的真正诞生。
PCR相关专利一直是个巨大的摇钱树。话说当年Roche以30亿美元的天价收购了Mullis所在的Cetus公司以及PCR专利，可是当时Cetus还和当时的Perkin Elmers公司合作开发PCR仪器，所以部分PCR专利依然被坚持牢牢控制在PE公司手里（后来PE和ABI分分合合中，落入ABI手里）。至于PCR酶，尽管Roche在美国的天然Taq专利无效（见Nature 402, 709; 1999），罗氏公司仍然拥有重组版的Taq专利。
罗氏和赛默飞一直是PCR技术的领导者。当然PCR酶领域其它公司有不可忽视的贡献。Stratagene的Pfu酶一向都是研究人员心目中最好的高保真酶，2007年6月安捷伦科技(Agilent Technologies ) 收购了Stratagene后，也归入安捷伦名下。KOD是从鹿儿岛县小宝岛的含硫气孔中分离出来的超嗜热原始菌Thermococcus kodakaraensis ，1995年 KOD上市后始终是东洋纺的拳头产品，就连赛默飞著名的Pfx DNA聚合酶也是一种从Thermococcus 菌株KOD中克隆得到的专利重组DNA聚合酶。
1996年美国ABI公司（或者说PE公司，这两个公司分分合合，有多年纠葛）研究出实时荧光定量PCR技术。 该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃, 而且采用了完全闭管检测, 不需PCR后处理, 避免了交叉污染。配以相应的荧光PCR仪, 整个PCR过程可实现自动化, 且耗时短, 操作方便, 较之传统的定量方法劳动强度小, 易于标准化和推广应用. 因而迅速在医学, 检验检疫, 军事, 农业, 科研等领域得到了推广应用。一开始的非特异性检测扩增序列的代表是SYBR Green I荧光染料。SYBR Green I只与DNA双链结合，插入DNA双链时发出荧光；DNA双链解链时释放出来，荧光信号急剧减弱。在一个加入过量SYBR green 1荧光染料的体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。荧光染料的优势在于能监测各种双链DNA序列的扩增，无需设计探针，检测简单简便，成本低廉。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，对DNA模板没有选择性，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号，引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。所以DNA聚合酶对于定量PCR反应保持特异性的重要作用，ABI采用化学修饰Taq酶得到高度严谨的热启动Taq，从而有效减少了非特异扩增，提高荧光染料法做定量PCR的特异性。这就是当年著名的ABI的“金牌”酶：AmpliTaq Gold® DNA Polymerase。AmpliTaq Gold如其名，确确实实是ABI定量PCR试剂中的一块金字招牌。AmpliTaq Gold通过对Taq酶的修饰确保在95℃才激活，根本上防止了反应前非特异性扩增。AmpliTaq Gold对Thermus aquaticus Taq DNA polymerase进行化学修饰改造-通过这种改造，修饰成份可以封闭AmpliTaq活性位点，在95℃之后，这种修饰成份也就从AmpliTaq上释放出来，还原AmpliTaq扩增活性。这样就确保了DNA在完全解链的情况下才会开始PCR扩增反应。Qiagen的HotStarTaq也进行了相似的改造。
顺便说一下，SYBR Green的非特异问题，当然不是只有一条途径。所谓条条道路通罗马，不同于Qiagen或者ABI利用的是提高DNA聚合酶的特异性，“曲线救国”，Invitrogen公司采用直接改造SYBR Green的方法，发展出更特异更灵敏的荧光染料——SYBR® GreenER™ qPCR Reagent System。SYBR Green原属于Molecular Probes公司的专利，但随着Probes被并购进入Invitrogen。
如果说金牌酶是第一代工程酶的话，Phusion高保真酶就是第二代工程酶的典范产品。
Finnzymes公司（现已被赛默飞世尔科技收购）独辟蹊径，将双链DNA结合蛋白（紫色）与一种新型的具有校对功能的类热球菌酶（绿色）融合，形成了一种独特的高性能聚合酶——Phusion® DNA聚合酶。聚合酶与Sso7d DNA结合结构域融合，从而改善了保真度、速度和性能可靠性。
在Finnzymes公司没有被收购之前，Phusion由Finnzymes公司开发和生产，NEB来销售。2010年Finnzymes被赛默飞收购，归入旗下。2012年NEB推出Q5超高保真DNA聚合酶，它与Phusion类似，也是聚合酶与Sso7d DNA结合结构域融合。伯乐推出过类似的酶。
与常规的化学修饰或抗体热启动不同，Phusion热启动利用了一种独特的适体（aptamer）。这种分子通过非共价相互作用与聚合酶可逆结合，在室温状态下阻断其活性；进入循环过程后，一旦到达高温，适体就会立即脱落，DNA聚合酶激活。Phusion热启动版本不需要像金牌酶一样开始的时候要单独热启动10 min。
高保真酶的一个主要弱点是产量偏低，一个重要原因是在PCR过程中由于dCTP脱氨基生成dUTP，dUTP的累积会造成所谓"PCR poisoning"，抑制PCR反应，也阻碍高保真酶的校正功能，从而限制了酶的精确度和延伸模版的能力。Stratagene添加ArchaeMaxx™聚合酶增强因子，能将dUTP分解为无毒的dUMP和焦磷酸，从而解除dUTP累积造成的影响，可以显著提高产量、减少扩增时间并可扩增更长的模板。
在PCR buffer的配方也是有更多的改进，TMAC、甜菜碱、新材料新化合物PCR添加剂等层出不穷，甚至复合型PCR添加剂，极大地提高DNA聚合酶的性能,，降低GC bias。然而，目前生物医药领域所使用的大部分生物酶都只是天然存在形式，即使有些酶经过基因工程改造，但是由于酶分子自身的结构和功能限制，要想得到真正满足科研工作人员需要的产品，却是一件费时费力的事情，而且常常达不到预期的要求。
正是因为如此，Kapa公司（被罗氏收购）利用“直接进化（directed evolution technology platform）”的专利技术平台上来筛选和生产高品质的生物酶，异军突起，生产了新一代的PCR酶。
直接分子进化又叫高通量分子进化（High-throughput Molecular Evolution），是运用遗传，基因工程，生物信息学等技术来在分子水平上设计真正满足不同实际要求的生物酶。无论是自己的体验，还是各种文献的报道，kapa HiFi Hot start Ready mix一直是最好的NGS文库构建酶。Kapa 2G Fast Multiplex也是一种经济高效的多重PCR文库构建酶，在遗传突变检测应用最为广泛，不过在检测低频突变时，更推荐Qiagen的那款。
DNA聚合酶的进化，还在继续。Kapa、赛默飞公司等仍在运用基因工程的手段改造DNA聚合酶，筛选更好的酶。另一方面，科学家在自然界也会找到更多新颖的DNA聚合酶，如NEB 公司的 Vent 和 Deep Vent DNA聚合酶系列，两者都是从海底火山口分离出来后克隆的，是普通 Taq 酶耐热性的三倍以上；华中科大在深海火山的病毒中第一个不需要引物的DNA聚合酶……从Taq酶起，一些极端环境就是盛产精品，我们有理由相信以后会发现更多惊喜。
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