食品微生物检测技术探讨

摘要：食源性致病菌已成为当前威胁世界食品安全的关键因素，因此建立食品微生物全套快速检测方略对确保食品质量、保障人类健康意义重大。文中从食品微生物检测的前处理、增菌、分离和富集以及检测各个环节综述了国内外最新研究进展，为建立一体化、实时食品微生物检测平台提供一定的基础。

随着人们生活水平的日益提高及公众安全意识的不断增强，食品安全作为一个关系国计民生的重大世界性公共卫生问题也备受关注。在诸多食品安全检测项目中，微生物污染是引发食源性疾病的最主要因素。因此，建立快速、准确、灵敏的现代微生物检测方法在食品安全监控中举足轻重。而食品微生物检测大致可分以下几个步骤，样品前处理、增菌、分离和浓缩到检测判定等各个环节，本文则着重解析探讨食品微生物快速检测的整套解决方略。

传统微生物检测方法包括形态观察、生化鉴定及血清学分型等冗繁的操作，已不能满足现代食品微生物检测对灵敏度、特异性和时效性的要求。因此，在基因、蛋白或是代谢水平上，融汇贯通生物学、物理学和化学等学科的最新技术，开发新的现代检测方法已成为当今食品微生物检测领域的一大热点。

分子生物学方法此类方法在基因水平上对靶标微生物进行检测，尤其适用于难培养或抗原结构复杂微生物的鉴定及分型，主要包括ＰＣＲ、核酸分子杂交及基因芯片等技术。这次主要分析以PCR为主及其相关的快检手段。

ＰＣＲ是一种体外酶促合成特定ＤＮＡ片段的技术，它通过以变性、退火和延伸３个步骤为一个周期的循环反应实现产物的指数级增长。早在１９９０年代，ＰＣＲ以其高灵敏度、特异性及快速等特点已在微生物检测中得到广泛应用。近年来，随着常规ＰＣＲ的不断成熟，其衍生技术也被逐渐开发并应用于微生物检测。相对于扩增单一靶基因的常规ＰＣＲ，多重ＰＣＲ通过在同一反应体系中加入多对特异性引物来实现在同一反应管中同时扩增多个目标基因，可用于同时检测多种微生物或通过多基因交叉确认来进行特定微生物鉴定或种下分型。如针对金黄色葡萄球菌的２３Ｓ ｒＲＮＡ、耐热核酸酶、血浆凝固酶以及８种肠毒素的编码基因分别设计特异引物，建立多重ＰＣＲ方法鉴别乳制品中该菌产肠毒素的类型；分别以沙门氏菌和单增李斯特菌基因和金黄色葡萄球菌基因作为靶标设计３对引物，通过优化反应体系，建立了能同时快速地检测食品中３种致病菌的三重ＰＣＲ法。

实时荧光定量PCR（quantitative real-time pcr，ｑＲＴ－ＰＣＲ）技术是于１９９６年推出的一种通过监测ＰＣＲ产物荧光信号的实时累积来定性或定量分析起始模板的方法。该法全程封闭式反应且无需ＰＣＲ后处理，避免了交叉污染及溴化乙锭等有毒物质的使用，具有特异性强、高度自动化等优点。通过选取特异性基因设计引物及探针，ｑＲＴ－ＰＣＲ法近年来已在多种致病细菌、霉菌、酵母以及乳酸菌等重要食品微生物指标的定性和定量检测中被广泛应用。许多研究者还在此基础上进行方法改良，进一步提高检测效率。如结合ＩＭＳ，ｑＲＴ－ＰＣＲ法无需前增菌即可准确、快速地检测大肠杆菌 O157:H7，有效缩短了检测周期。

尽管上述ＰＣＲ及其衍生技术具有高灵敏度、快速等优点，但方法实施所需的昂贵仪器设备严重限制了其在我国食品检测机构的推广应用。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是于2000年开发的一种无需扩增仪、结果可通过扩增副产物的浊度直观判定的新型核酸扩增法。它通过高效链置换技术，可在１ｈ内于恒温条件下特异扩增ＤＮＡ达109～1010个拷贝。该法无需经历复杂变温循环扩增过程，混样后仅需一个恒温反应器即可在短时间内完成，较之其他ＰＣＲ法具有无以比拟的快速、简便、高灵敏及直观等优点，因而在食品微生物检测领域越发受到青睐。２０１１年，我国也发布并实施了针对出口食品中１５种致病菌的ＬＡＭＰ检测方法的出入境检验检疫行业标准 SN/T2754.12-2011。

但LAMP检测方法也同样存在一定的缺陷，比如它的恒温条件是需要达到60-65℃，同样需要依靠一些特定仪器，也就导致不能做到现场的检验检测，同时也易出现假阳性结果。

酶促重组等温扩增（ERA）技术，凭借其技术在核酸检测领域开发了三大核心（www.gendx.cn），1、体温扩增技术，能在恒温条件下，将痕量的核酸模板扩增到可以检出的水平；2、单分子荧光检测技术，集恒温扩增与荧光信号检测于一体，可实现扩增过程的实时检测；3、核酸快速释放技术，为实验节省更多的时间。该方法低温条件下（25-42℃）可对痕量的靶DNA片段进行特异性的扩增，在最适温度35-40℃时，扩增反应时间仅需15分钟，其低温适应性和灵敏度等方面取得了重大突破并达到国际先进水平，而且摆脱国外专利壁垒，该技术已广泛应用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌、副溶血性弧菌、李斯特氏菌等病原体检测。

总而言之，现代食品卫生安全对于社会公民的健康非常重要，也是大家非常关注的一个问题，现在食品安全问题频发，引起了大家的广泛讨论，我们需要不断对食品安全检验技术进行完善，寻找快速、精准，简便的检验方式，传统的检验方式无法满足现代的需求，目前兴起的基因探针技术以及全自动微生物检测系统的应用，获得了非常好的效果，对微生物检验方法起到了非常好的改变，提升了该事业的科技水平，因此其未来的发展前景不可限量，我们对食品微生物检验方法进行研究分析，也是希望能够促进该项事业的发展。