论文：CircRNA expression profile and functional analysis in testicular tissue of patients with non-obstructive azoospermia（非梗阻性无精子症睾丸组织CircRNA表达谱及功能分析）
不孕症是一个世界性的生殖健康问题，影响到全球约7000万人。据世界卫生组织估计，有10-15%的夫妇患有不孕症，男性因素约占所有不孕病例的一半。
不幸的是，近60-75%的男性不育原因不明或特发性，因为这些缺陷的分子机制尚不清楚。非梗阻性无精子症(NOA)是男性不育最严重的表现，精子发生过程受到干扰。影响1%的男性和10%寻求生育援助的人。
研究还表明，NOA约占无精子症的60%，其中精子发生过程不活跃，因此不能产生精子细胞。到目前为止，NOA是一种多因素紊乱，其分子基础尚不清楚。
虽然显微解剖睾丸精子摘除术(Microtese)是NOA的标准治疗方法，但约50%的患者不能成功地进行精子摘除。因此，我们面临的挑战是阐明精子发生过程中的精确分子机制，为NOA患者寻找有效的诊断指标或治疗靶点。
因此，本研究旨在研究mRNA在NOA患者中的表达谱和功能。生物信息学分析还可用于鉴定圆环RNA/miRNA/mRNA相互作用网络、生物过程和信号通路。这些结果为开发新的NOA诊断和治疗策略提供了潜在的靶点。
· 病人和方法
· RNA提取与质量控制
· CircRNA微阵列标记和杂交
· 微阵列数据采集与分析
· 用qRT-PCR方法验证圆环RNA
· CircRNA/miRNA相互作用及圆环RNA/miRNA/mRNA调控网络分析
· 生物信息学分析
· 统计分析
分层聚类图显示NOA患者睾丸组织及对照组的圆环RNA表达谱。方框图表明，归一化后NOA和对照的圆环RNA分布基本相同。散点图显示NOA与对照组圆环RNA表达的差异。
散点图中的X和Y轴值是样本的归一化信号值（log2标度）。绿线是折换线。顶绿线上方和底绿线下方的圆环RNA表明，两种样品的圆环RNA变化均在2.0倍以上。如果CircRNA至少有两倍的上调或下调，则它们被认为具有显著的差异表达。
共检测到4169个人圆环RNA。其中526个人圆环RNA表达上调，368个在NOA患者睾丸组织中表达下调(AFC>2.0和P < 0.05). According to the genomic origin of human circRNAs, the classification of the differentially expressed circRNAs was summarized in pie chart (Fig. 1d)。
它们大多属于外显子类圆环RNA。具体而言，526个上调的转录因子由479个外显子、26个内含子、8个反义和13个基因内组成。此外，368个下调的转录因子包括316外显子，31个内含子，6个反义和15个基因内。1d)。
为证实crRNA微阵列结果，随机选取6种差异表达的crRNA进行了qRT-PCR分析，包括3种上调的crRNA(hsa_CIRC_0058058、hsa_CIRC_0008045和hsa_CIRC_0023313)和3种下调的圆环RNA(hsa_CIRC_0061817、hsa_CIRC_0002023和hsa_CIRC_0008533)，其中hsa_CIRC_0058058、hsa_CIRC_0008045和hsa_CIRC_0023313。
结果表明，所筛选的圆环RNA的表达模式与微阵列数据一致。其中HSA_CIRC_0023313(对照1.30±1.33，NOA 16.46±2.81，P=0.002)，hsa_circ_0008045(对照1.00±0.32，NOA 4.12±0.51，P和HSA_CIRC_0058058(控制值0.98±0.43，NOA 16.93±1.48)，PHsa_CIRC_0061817(对照组1.04±0.24，NOA 0.58±0.19)。
P=0.061)，hsa_circ_0002023(对照1.00±0.29，NOA 0.46±0.13，P和hsa_circ_0008533(对照0.99±0.26，NOA 0.60±0.16)，PNOA患者与对照组比较，其表达水平明显下降(P<0.012)。
已有研究表明，圆环RNA作为miRNA“海绵”，具有竞争性抑制miRNA活性和进一步调控基因表达的功能。为了寻找潜在的环RNA/miRNA在NOA中的相互作用，选择了一种已证实的圆环RNA(Hsa_CrcRNA_0023313)进行进一步的生物信息学分析和预测。
对于hsa_CircRNA_0023313，最有可能的靶基因是hsa-miR-520 d-3p，hsa-miR-373-3p，hsa-miR-372-3p，hsa-miR-302C-3p和hsa-miR-130 b-5p。MiRNA反应元件(MRES)的序列分析如图所示。
“2D结构”显示MRE序列、目标miRNA种子类型和3‘配对序列。“本地AU”显示了Au含量为30 nt的上游和下游种子序列。红条代表A/U和高可达性，黑条代表G/C和种子的低可达性。此外，可访问性的程度是由杆的高度来表示的。“位置”表示在hsa_crcRNA_002313线性表示上最有可能的相对MRE位置。
圆环RNA/微RNA/mRNA相互作用网络图。根据hsa_crna_0023313-靶向miRNAs（包括hsa-miR-520 d-3p，hsa-miR-373-3p，hsa-miR--302C-3p和hsa-miR-130 b-5p)的预测目标基因。
Go分析和KEGG通路分析预测hsa_crcRNA_0023313的潜在生物学功能。对hsa_CircRNA_0023313的细胞成分分析表明，其靶基因主要涉及细胞质、胞浆、自噬体和自噬体。
生物过程分析表明，其靶基因主要参与转录的正调控、DNA模板化、RNA聚合酶II启动子转录的正调控和共价染色质修饰等。此外，分子功能分析表明hsa_CircRNA_0023313主要参与泛素-蛋白转移酶活性、染色质结合和ATP-结合等。
KEGG分析表明，与hsa_CircRNA_0023313相关的前五条途径分别为内吞、减数分裂、FoxO信号通路、Ubiquitin介导的蛋白水解和AMPK信号通路。
综上所述，本研究首次阐明了周期RNA在NOA患者睾丸组织中的综合表达模式，提示其可能在调节精子发生中起重要作用，可能是NOA诊断和治疗的潜在分子靶点。然而，对于圆环RNA在精子发生中的具体作用的分子机制还有待于进一步的探索。
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