材料和方法
动物与实验设计
所有实验均在体重180–200 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠身上进行，这些大鼠是从BioLASCO台湾有限公司随机获得的。所有动物都被安置在温度为22°C、相对湿度为55%的动物设施中，在12小时的明暗循环中，食物和无菌自来水可随意提供。所有程序均获高雄医科大学动物护理及使用委员会批准（批准文号：10048）。将大鼠分为4组（每组6只）：A组，假烧伤后4周注射生理盐水（假烧伤+生理盐水）；B组，假烧伤后4周注射脂肪（假烧伤+脂肪移植）；C组，烧伤后4周注射生理盐水（烧伤+生理盐水）；D组，注射脂肪移植烧伤后4周（烧伤+脂肪移植）。实验流程如图1A所示。
图1。这项研究的流程图和来自不同群体的行为测试。
（A） 研究D（天）和W（周）的流程图。（B） 烧伤后1～4周，C组和D组伤侧后肢对机械刺激的反应阈明显降低。脂肪移植后，D组的阈值在随后的几周内显著高于C组。（C）对辐射热刺激的反应阈值在两组之间没有显示出显著差异。每组的样本量为n=6。（数据以平均值±SEM绘制；***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05）。
全厚度烧伤及行为学试验
如我们之前的研究[4]所述，三度烧伤是由于右后爪放在75±0.5°C的加热金属块上，在用舒泰®50（50 mg/kg体重）麻醉的情况下，将后爪置于100 g重量的水浴中10秒（法国卡罗斯Virbac实验室）。磺胺嘧啶银乳膏敷于伤口约3周，直至愈合。在烧伤前1天，烧伤后4周，每隔1周再进行4周，采用与我们先前研究相同的方法测量爪子撤退潜伏期试验（PWLs）和爪子撤退阈值试验（PWTs）。
在烧伤的后爪和对侧测量这些行为反应。PWL用于评估热痛觉过敏。采用足底试验记录PWL（Hargreaves仪器，Ugo Basile，Varese，Italy）。简言之，一个红外线辐射热源被放置在后足跖面的下方。从应用热源到后爪抽出的时间定义为PWL（以秒为单位）。
使用动态足底感觉计（Ugo Basile，Varese，Italy）记录PWT。将大鼠放在金属网上，用自动测试仪用金属棒（直径2 mm）对后肢足底表面进行机械刺激。施加在杆上的压力以2.5 g/秒的速率增加，直到动物抽出爪子，这被记录为最低力（g）。每次测量以10分钟为间隔重复6次，后爪应用之间休息30分钟。
自体脂肪移植
烧伤后4周，在舒泰50麻醉下取左侧腹股沟脂肪。用剪刀将脂肪组织切成块，并将其吸入1ml注射器中，直到达到0.4ml的体积。用19号针头将脂肪移植物注射到烧伤后足掌皮下。供区用尼龙4-0封闭。对照组用0.4ml生理盐水于烧伤后足皮下注射。
蛋白质印迹分析
烧伤后4周，用过量的舒泰50处死大鼠。收集腰椎3，4，5（L345）脊髓，分离背角区和皮肤，液氮冷冻，在-80℃保存。L345背角标本和皮肤在冰凉溶解缓冲液中均质化，T-PER组织蛋白提取试剂（Thermo Scientific），每25 mL含一片完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche），然后在4°C下离心（15000 g）30分钟。以牛血清白蛋白为标准测量上清液中的每种蛋白质浓度。westernblots的程序和分析是通过与我们之前的报告相同的方法进行的[26]。COX-2（1:1000，Cell Signaling，Danvers，MA），iNOS（1:1000，Abcam，Cambridge，MA），nNOS（1:1000，Abcam，Cambridge，MA），蛋白激酶B（AKT）（1:1000，Cell Signaling，Boston，MA），p-AKT（1:1000，Cell Signaling，Boston，MA），Bcl-2相关X蛋白（Bax）（1:1000，Proteintech Group，Chicago，IL），Bcl-2（1:1000，Abcam，剑桥，马萨诸塞州）和β-肌动蛋白（1:20000稀释，西格玛奥尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）用于本研究。
免疫组化（IHC）检测COX-2、iNOS和nNOS
后爪皮肤用福尔马林固定并包埋于石蜡中，10μm厚的皮肤被切割并固定在载玻片上，脱蜡并在分级酒精溶液中再水化。皮肤切片通过在高压灭菌器中将切片在0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中加热至121℃10分钟并将切片缓慢冷却至室温来进行抗原回收。此外，切片用3%的H2O2孵育5分钟，以抑制内源性过氧化物酶活性。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中用5%山羊血清阻断非特异性部位30分钟后，切片在4℃下与抗COX-2（1:200，Cell Signaling，Danvers，MA）、iNOS（1:200，Abcam，Cambridge，MA）和nNOS（1:200，Abcam，Cambridge，MA）的兔多克隆抗体一起培养过夜。然后在室温下将切片与辣根过氧化物酶结合的二级抗体孵育30分钟。最后，载玻片在3,3-二氨基联苯胺中孵育5分钟，然后进行Mayer苏木精复染60秒并安装。
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