作者:解螺旋.子非鱼
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一直以来,Premier5和Oligo软件可以说是设计PCR引物的经典存在,那么有着强大引物自动搜索功能的Premier5遇到评价分析能力强悍的oligo,势必会碰撞出巨大的火花,则今天小鱼就把PCR引物设计的经典套路介绍给大家。当然,任性到连软件都不想下载的小伙伴们可回复primer,即可查看在线设计PCR引物的三种方法。
以小鼠的IL-17为例,进入NCBI界面,选择Nucleotide后,输入IL-17,点击search.
然后选择第三个选项——人类IL-17的mRNA,在CDS选项中,找到编码区所在位置,在下面的origin中,选定目的序列。
3.点击Primer,弹出菜单后点击search按钮。
PCR产物长度,点击OK。
在弹出的search progress菜单中,点击OK。
4.在搜索出的结果列表里选择Rating值高,bug较少的引物#1,在Primer Premier中选择S(正义链)/A(反义链),点击edit primer,将所得引物改成为Rating值为100,无bug的引物,即无发夹(Hairpin)、无二聚体(Dimer)、无错配(False Priming)和交叉配对(Cross Dimer)的引物。
打开Oligo界面如下:
单击菜单栏里File∣New Sequence可打开以下窗口。并将设计好的上游引物黏贴在空白框里。
2.点击菜单栏里Accept/Discard中的Accept,则会出现Tm、△G和Frq三个窗口, △G值反应了序列与模板的结合强度,最好引物的△G值在5’端和中间值比较高,而在3’端相对较低。
3.点击菜单栏里的Select中的Upper Primer将当前引物设置为上游引物。同时点击菜单栏里的Edit中的“Lower Primer”命令,在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列。
4.最后,在菜单栏中Analyze完成引物各种分析即可。
①Analyze中,第一项为Key info,点击Selected primers,会给出两条引物的概括性信息,其中包括引物的Tm值,此值Oligo是采用nearest neighbor method计算,会比Premier5中引物的Tm值略高,此窗口中还给出引物的△G和3’端的△G。3’端的△G过高,会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应,因此此项绝对值应该小一些,最好不要超过9。
引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素,因此应该避免设计的引物存在二聚体,至少也要使设计形成的引物二聚体是不稳定的,即其△G应该偏低,一般不要使其超过4.5kcal/mol,结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和△G值。
③Analyze中第三项为Hairpin Formation,即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物,同样,△G值不要超过4.5kcal/mol,碱基对不要超过3个。
④Analyze中第四项为Composition and Tm,会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC%需要控制在40%~60%,而且上下游引物之间的GC% 不要相差太大。Tm值共有3个,分别采用三种方法计算出来,包括nearest neighbor method、%GC method和2(A+T)+4(G+C)method,最后一种应该是Premier5所采用的方法,Tm 值可以控制在50~70度之间。
⑤第五项为False Priming Sites,即错误引发位点,在Premier5中虽然也有False priming分析,但不如oligo详细,并且oligo会给出正确引发效率和错误引发效率,一般的原则要使误引发效率在100以下,当然有时候正确位点的引发效率很高的话,比如达到400~500,错误引发效率超过100幅度若不大的话,也可以接受。
⑥Analyze中,有参考价值的最后一项是“PCR”。在此窗口中,是基于此对引物的PCR反应Summary,并且给出了此反应的最佳退火温度。另外,提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在,并且△G值偏大的话,Oligo在最后的评价中会注明,若没有注明此项,表明二级结构能值较小,基本可以接受。
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