作者:Lucky King(转载请注:解螺旋·医生科研助手)
标题:MicroRNA-1185通过靶向UVRAG和KRIT1诱导内皮细胞凋亡(回复170509可下载文献)
估计各位小主儿,关于mi-RNA这个级别的文献讲解已经看腻了。腻,就对了,说明熟透了。朕也腻歪了,今天再撩一次5分傻白甜,下周咱们进阶白富美O(∩_∩)O~
作者做动脉粥样硬化这种多因素慢性疾病,内皮损伤和凋亡在动脉粥样硬化的发生和发展中起关键作用。然后化病为模,选定内皮做细胞模型。(先前大家做明星分子、通路的细胞膜型,不妨拿出来重新用RNA数据库筛下)
miRNA是长度约为22个核苷酸内源性非编码单链RNA分子,与其靶mRNA的3'-非翻译区中的不完全互补序列结合以介导转录后基因表达。
采用硬脂酸处理细胞,建立模型
与对照组相比,miRNA微阵列数据确定了硬脂酸处理组中有48个miRNA上调和5个miRNA下调,其中miR-1185表达在硬脂酸处理组中增加最多,为8.78倍,并用qPCR进行了验证。
与NC组相比,miR-1185转染pHUVEC细胞显著增强LDH释放,转染miR-1185抑制剂后几乎完全消除了miR-1185的作用,LDH释放量恢复(Fig.1a);
评估细胞凋亡:
miR-1185组断裂的caspase-3蛋白表达量升高,显示出凋亡形态特征(Fig.1b),Hoechst 33342染色,观察到如核收缩、染色质凝聚等凋亡形态特征(Fig.1c)。但是这些凋亡特征,在共转染miR-1185抑制剂后逆转。
检测miR-1185在EA.hy926细胞系的作用
转染miR-1185后,EA.hy926细胞LDH表达量显著升高,断裂的caspase-3蛋白表达量显著升高。共转染miR-1185抑制剂到EA.hy926细胞中,LDHmRNA和断裂的caspase-3蛋白表达量恢复(Fig.2a-b)。
通过PI染色测量EA.hy926细胞凋亡百分比,miR-1185转染组凋亡显著增加,共转染miR-1185抑制剂组显著降低了miR-1185的效果,降低了细胞凋亡(Fig.2c)。
此外,用miR-1185转染HAEC细胞,获得的结果相似(Fig.3a-b)。
结果表明miR-1185过表达可诱导内皮细胞损伤和凋亡。
miR-1185的上调没有引起HUVSMC和THP-1细胞的损伤和凋亡
血管平滑肌细胞和巨噬细胞的凋亡参与动脉粥样硬化的发病机理,上述实验表明miR-1185导致内皮细胞凋亡,但miR-1185的上调对血管平滑肌细胞和巨噬细胞是否影响,接下来进行了研究。
用miR-1185转染HUVSMC和THP-1细胞后,检测LDHmRNA、断裂caspase-3蛋白表达量,与NC组相比没有表现出显著损伤或细胞凋亡(Fig.4a-c)。
这些结果表明miR-1185的上调不会影响血管平滑肌细胞和巨噬细胞的活力。
miR-1185特异性抑制UVRAG和KRIT1表达
miR-1185促进内皮细胞凋亡,TargetScan6.2进行生物信息学分析,预测miR-1185潜在mRNA靶标,发现了UVRAG和KRIT1。
UVRAG已被鉴定为调节凋亡Bcl-2相关X蛋白(BAX)的抑制因子,UVRAG的缺失上调BAX诱导的细胞凋亡。
KRIT1的缺失会促进斑马鱼胚胎、人内皮细胞的凋亡。
TargetScan预测,UVRAG/KRIT1的3'-UTR中序列可以与miR-1185碱基互补配对(Fig.5a);
荧光素酶测定显示:miR-1185过表达质粒和UVRAG/KRIT1基因野生型(3'UTR-WT)质粒共转染显著降低HEK-293细胞中荧光素酶活性,突变组(3'UTR-MUT)则未受影响(Fig.5b-c);上述数据表明,UVRAG和KRIT1是miR-1185的靶标。
为了进一步证实荧光素酶结果,转染pHUVEC细胞,测定UVRAG/KRIT1蛋白表达量,miR-1185过表达显著降低UVRAG/KRIT1蛋白水平;使用miR-1185抑制剂组部分地减弱了miR-1185介导的UVRAG/KRIT1下调(Fig.5d-e)。
此外,作者还检测了硬脂酸处理的HUVSMC、THP-1等细胞中的UVRAG和KRIT1,得到了相似结果。
UVRAG/KRIT1的消耗导致pHUVEC凋亡
功能失活实验验证UVRAG/KRIT1对内皮细胞凋亡的作用,UVRAG-siRNA/KRIT1-siRNA转染pHUVEC,并对凋亡相关指标进行检测。
先验证基因沉默没毛病,UVRAG-siRNA/KRIT1-siRNA转染有效地降低了UVRAG/KRIT1蛋白表达(图在补充材料)。
UVRAG/KRIT1特异性敲除后,显著增加LDH释放(Fig.6a-b);
流式细胞仪检验PI染色评估细胞凋亡表明,siRNA-UVRAG/siRNA-KRIT1的下调显著增加凋亡细胞的百分比(Fig.6c-d);
Western印迹分析表明,siRNA沉默UVRAG/KRIT1后强烈上调断裂的caspase-3蛋白表达(Fig.6e-f)。
这些结果与miR-1185过表达实验一致,表明沉默UVRAG/KRIT1可引起内皮细胞的损伤和凋亡。
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