作者：Lucky King（转载请注：解螺旋·医生科研助手）
标题：MicroRNA-1185通过靶向UVRAG和KRIT1诱导内皮细胞凋亡（回复170509可下载文献）
估计各位小主儿，关于mi-RNA这个级别的文献讲解已经看腻了。腻，就对了，说明熟透了。朕也腻歪了，今天再撩一次5分傻白甜，下周咱们进阶白富美O(∩_∩)O~
作者做动脉粥样硬化这种多因素慢性疾病，内皮损伤和凋亡在动脉粥样硬化的发生和发展中起关键作用。然后化病为模，选定内皮做细胞模型。（先前大家做明星分子、通路的细胞膜型，不妨拿出来重新用RNA数据库筛下）
miRNA是长度约为22个核苷酸内源性非编码单链RNA分子，与其靶mRNA的3'-非翻译区中的不完全互补序列结合以介导转录后基因表达。
采用硬脂酸处理细胞，建立模型
与对照组相比，miRNA微阵列数据确定了硬脂酸处理组中有48个miRNA上调和5个miRNA下调，其中miR-1185表达在硬脂酸处理组中增加最多，为8.78倍，并用qPCR进行了验证。
与NC组相比，miR-1185转染pHUVEC细胞显著增强LDH释放，转染miR-1185抑制剂后几乎完全消除了miR-1185的作用，LDH释放量恢复（Fig.1a）；
评估细胞凋亡：
miR-1185组断裂的caspase-3蛋白表达量升高，显示出凋亡形态特征（Fig.1b），Hoechst 33342染色，观察到如核收缩、染色质凝聚等凋亡形态特征（Fig.1c）。但是这些凋亡特征，在共转染miR-1185抑制剂后逆转。
检测miR-1185在EA.hy926细胞系的作用
转染miR-1185后，EA.hy926细胞LDH表达量显著升高，断裂的caspase-3蛋白表达量显著升高。共转染miR-1185抑制剂到EA.hy926细胞中，LDHmRNA和断裂的caspase-3蛋白表达量恢复（Fig.2a-b）。
通过PI染色测量EA.hy926细胞凋亡百分比，miR-1185转染组凋亡显著增加，共转染miR-1185抑制剂组显著降低了miR-1185的效果，降低了细胞凋亡（Fig.2c）。
此外，用miR-1185转染HAEC细胞，获得的结果相似（Fig.3a-b）。
结果表明miR-1185过表达可诱导内皮细胞损伤和凋亡。
miR-1185的上调没有引起HUVSMC和THP-1细胞的损伤和凋亡
血管平滑肌细胞和巨噬细胞的凋亡参与动脉粥样硬化的发病机理，上述实验表明miR-1185导致内皮细胞凋亡，但miR-1185的上调对血管平滑肌细胞和巨噬细胞是否影响，接下来进行了研究。
用miR-1185转染HUVSMC和THP-1细胞后，检测LDHmRNA、断裂caspase-3蛋白表达量，与NC组相比没有表现出显著损伤或细胞凋亡（Fig.4a-c）。
这些结果表明miR-1185的上调不会影响血管平滑肌细胞和巨噬细胞的活力。
miR-1185特异性抑制UVRAG和KRIT1表达
miR-1185促进内皮细胞凋亡，TargetScan6.2进行生物信息学分析，预测miR-1185潜在mRNA靶标，发现了UVRAG和KRIT1。
UVRAG已被鉴定为调节凋亡Bcl-2相关X蛋白（BAX）的抑制因子，UVRAG的缺失上调BAX诱导的细胞凋亡。
KRIT1的缺失会促进斑马鱼胚胎、人内皮细胞的凋亡。
TargetScan预测，UVRAG/KRIT1的3'-UTR中序列可以与miR-1185碱基互补配对（Fig.5a）；
荧光素酶测定显示：miR-1185过表达质粒和UVRAG/KRIT1基因野生型（3'UTR-WT）质粒共转染显著降低HEK-293细胞中荧光素酶活性，突变组（3'UTR-MUT）则未受影响（Fig.5b-c）；上述数据表明，UVRAG和KRIT1是miR-1185的靶标。
为了进一步证实荧光素酶结果，转染pHUVEC细胞，测定UVRAG/KRIT1蛋白表达量，miR-1185过表达显著降低UVRAG/KRIT1蛋白水平；使用miR-1185抑制剂组部分地减弱了miR-1185介导的UVRAG/KRIT1下调（Fig.5d-e）。
此外，作者还检测了硬脂酸处理的HUVSMC、THP-1等细胞中的UVRAG和KRIT1，得到了相似结果。
UVRAG/KRIT1的消耗导致pHUVEC凋亡
功能失活实验验证UVRAG/KRIT1对内皮细胞凋亡的作用，UVRAG-siRNA/KRIT1-siRNA转染pHUVEC，并对凋亡相关指标进行检测。
先验证基因沉默没毛病，UVRAG-siRNA/KRIT1-siRNA转染有效地降低了UVRAG/KRIT1蛋白表达（图在补充材料）。
UVRAG/KRIT1特异性敲除后，显著增加LDH释放（Fig.6a-b）；
流式细胞仪检验PI染色评估细胞凋亡表明，siRNA-UVRAG/siRNA-KRIT1的下调显著增加凋亡细胞的百分比（Fig.6c-d）；
Western印迹分析表明，siRNA沉默UVRAG/KRIT1后强烈上调断裂的caspase-3蛋白表达（Fig.6e-f）。
这些结果与miR-1185过表达实验一致，表明沉默UVRAG/KRIT1可引起内皮细胞的损伤和凋亡。
联系客服
