作者：Lucky King
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在肺肿瘤发生过程中染色体12qF1的miRNA表达增加
小鼠肺肿瘤代表图像，正常非诱导（N）、它莫西芬诱导的非肿瘤性（4-OHT+N）、肺增生（Hyp）、肺腺瘤（Ad）、腺癌（AdCa）（Fig.1A）；
分析显示在肺癌发展过程中大部分miRNAs表达异常（补充图1A）；
与肿瘤前、癌性病变组织相比，非肿瘤组织表现出明显不同的miRNA表达谱（Fig.1B）；
鼠染色体12qF1簇中大多数miRNA（30/54，55％）在肺组织癌转化过程中过表达（Fig.1C，黑点无改变，红点改变量最大）；
通过qPCR证实了染色体12qF1中的miRNA上调（补充图1B）。
已知12qF1中miRNA的表达与小鼠老化相关，接下来按着不同时间段、年龄段从模型小鼠身上取非肿瘤肺组织。数据显示，12qF1的miRNAs不受肺衰老影响，因为，26个miRNAs（48％）在所有样本中均未表达，15个miRNA（28％）在所有标本中都表现出相当水平。在老年组织中，分别仅有9个（17％）和4个（7％）的miRNA，分别减少或者过表达（补充图1C）。
因此，来自K-Ras(+/LSLG12Vgeo);RERTn(ert/ert)小鼠模型肺组织中染色体12qF1簇 中miRNA的上调与肺癌发生相关，排除衰老影响。
14q32 miR-494-3p与肺癌患者预后相关
鼠染色体12qF1 miRNA区域，相应的人类基因组是保守序列，在染色体14q32的DLK1-DIO3位点。
从57例NSCLC患者中，分析一个亚型（n=10）中的miRNA（miR-127、-300、370、-379、-382、-409-3p、-412、-431、-494-3p和-543）。尽管与正常组织相比，这些miRNA在肺癌中一般不会显著表达（附图2A），但是miR-494-3p表达水平较高的患者，其无病生存时间较短（p=0.046;补充图2B）；
NSCLC患者扩大样本到113例，miR-494-3p高水平表达患者与较短的总生存期显著相关（p=0.03;Fig.2A）；其他miRNA不存在单独与NSCLC患者存活率相关（一个没影响）。然而，14q32染色体中大多数（9/10）miRNA在肿瘤组织中表达的升高与患者无病生存率的缩短存在相关性（多了就影响了，Fig.2B）；
研究14q32 miRNAs表达与肿瘤干细胞标志物之间的潜在关系，检查53个肿瘤样本中CD44、ABCG2、ALDH1A1、NANOG和c-MYC基因的表达（Fig.2C和补充图2C）。当肿瘤细胞中14q32 miRNAs共同（>8）上调时，ABCG2的表达量显著上调（Fig.2C）；
miR-494-3p在侵袭性前体中的表达明显高于肿瘤体（Fig.2E）；
其他miRNA的表达在两个肿瘤区域之间是无法区分的（补充图2D）。
从小鼠肺癌模型和患者样本得出：miR-494-3p和14号染色体miRNA簇与NSCLC中ABCG2-阳性表型具有相关性。
调控miR-494-3p的表达
在NSCLC中检测到前体pri-miR-494与其成熟miR-494-3p的表达之间存在直接相关性（Fig.3A）；
具有pri-miR-494高表达的肿瘤显示出较高的miR-494-3p水平（Fig.3B）；
接下来检测表观遗传学，16CpG位点区域中的基因间甲基化差异（IG-DMR）。正常组织（60.9％）显示比相对应肿瘤（40％）更高的IG-DMR CpG甲基化水平（Fig.3C-D）；
相对于非肿瘤性肺组织，肿瘤中IG-DMR去甲基化更为明显，肿瘤细胞中pri-miR-494表达水平明显升高（Fig.3E）；
检测了14号染色体33区域的亚显微基因组改变，但该区域不包括DLK1-DIO3基因座（见补充材料），14q基因组与pri-miR-494表达之间没有直接的相关性（Fig.3F）；
结果显示：后期的修饰改变可能有助于miR-494-3p在肺癌中的调控，而不是基因层面的改变进行的调控，接下来研究NSCLC中潜在的miR-494-3p相关信号通路。
miR-494-3p调节参与癌症发展过程的通路
在A549细胞中，分析了受miR-494-3p表达调控的36个涉及重要癌症途径的基因（补充材料）；
与对照组相比，miR-494-3p的强制表达不影响细胞凋亡相关机制（Fig.4A）；
但是与对照相比，显著增加了PROM1，CDKN1A，NUMBL和KLF4的水平，4个与干细胞相关的mRNA（Fig.4B）；
miR-494-3p过表达之后，间质转化因子（EMT）发生上调，ZEB2和S100A的mRNA显著增加（Fig.4C）；
通路分析表明：miR-494-3p调节影响涉及“细胞死亡和存活、胚胎发育、生物发育”等细胞调控网络（Fig.4D，红色上调、绿色下调）；
miR-494-3p参与肺肿瘤起始种群维持
为了更好地了解14q32 miRNAs，特别是miR-494-3p在肿瘤干细胞维持中作用，从A549肺癌细胞分选SP和NSP细胞群体（Fig.5A）；
A549细胞中，10个14q32 miRNA中有8个的表达在基线条件下（miR-127、379、382、40-4-3p、-412、-431、-494-3p和-543）（补充图3B）；SP细胞与NSP细胞相比表现出明显不同的miRNAs表达谱（Fig.5B）；
miR-494-3p miRNA表达差异最高的miRNA（Fig.5C）；
在A549中过表达miR-494-3p，并通过流式细胞仪检查SP细胞区域的百分比。与对照相比，较高水平的miR-494-3p导致SP的显著增加（Fig.5D-E）；
使用miR-494-3p抑制剂转染A549，降低其表达后，与对照相比并不影响SP比例（补充图3C-D）；
与对照相比，非贴壁培养条件下，转染miR-494-3p模拟物表达显著增强了A549球形成能力，增加球型大小（Fig.5F-G）；
异种移植检测miR-494-3p在体内维持肿瘤生长中的作用，将转染过表达miR-494-3p/对照miRNA的A549细胞皮下注射到无胸腺小鼠。注射18天后，与对照相比，miR-494-3p过表达组产生较大的肿瘤（Fig.5H-I）。
miR-494-3p过表达增强肿瘤活性
分析miR-494-3p在肿瘤细胞运动和转移中的作用。
在伤口愈合实验：miR-494-3p过表达后显著增强了A549细胞迁移能力（Fig.6A）；在补充实验中还进行Boyden chamber实验。
将A549细胞注射到无胸腺小鼠的外侧尾静脉，在第11天和第17天通过MRI（核磁）监测到肺癌灶形成（Fig.6B-C）；
第18天收小鼠肺样本，组织切片进行评分。与对照组相比，miR-494-3p过表达注射组，小鼠表现出转移病灶数目和表面积显著增加（Fig.6D-E）；未检测到肝转移。
miR-494-3p有助于NOTCH1途径和PTEN调节
分析10个致癌转录因子，A549-miR-494-3p过表达细胞表现出NOTCH1通路活性显著增加（Fig.7A）；
已知的NOTCH1靶基因，CDKN1A和RBP-jk的mRNA也显著上调（Fig.7B）；
在蛋白水平，miR-494-3p过表达增加了总NOTCH1、细胞内NOTCH1（NICD）、CDKN1A的蛋白表达量（Fig.7C）；NOTCH1激活、PTEN被抑制。
miR-494-3p过表达与PI3K途径活化相关：AKT在Ser473磷酸化，AKT2在Ser474磷酸化、总AKT、AKT激活的PDK1、pS6RP蛋白均显著上调（Fig.7E）；
相比之下，miR-494-3p的水平降低并不影响NOTCH1激活、NOTCH1靶标CDKN1A的水平以及A549细胞中PI3K信号传导的水平（补充材料）；
体外切片观察到类似结果：miR-494-3p过表达异种移样本，病灶切片显示磷酸化-S6RP染色增加（Fig.7F-G）；
实验完了，理一下故事线
miR-494-3p促进PI3K信号传导的激活，同时在肺癌细胞中激活AKT-mTOR-pS6RP，进而助于肿瘤细胞增殖；同时，miR-494-3p可激活NOTCH1信号转导途径以及下游基因（参与EMT和cancer stemness）的表达。
这些结果指示出，一新的miR-494-3p-NOTCH1-PI3K信号转导方式调控肺癌发生和转移的激活。
我收获了两点：1、Fig.4D的做法值得去摸索摸索。2、知道了新概念，miRNA簇。补充图&材料感兴趣的小主儿可以从后台下载，就不再展开了。
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