孙英丽博士：前列腺癌液体诊断技术的诞生与成果转化

作者：麦子

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5月20日~21日在北京举行的生物标志物与液体活检论坛圆满闭幕，会上，中国科学院北京基因组研究所的孙英丽博士的报告获得了绝大多数与会人员的好评与关注。她在前列腺癌无创液体诊断上的研究取得了很好的成果，并实现了技术转化。下面我们来回顾一下她的精彩报告。

前列腺癌（PCa）的检测，现行的生物标志物是前列腺特异性抗原（PSA），但它有一个灰度区间，即在4-10ng/ml范围内，是无法确定患者是否发生了癌变，而且落在这个区间的患者比例还不小，有20%-30%左右。此时医生会建议患者做活检，从而带来额外的心理和经济负担。于是也已经有不少课题组展开了研究，发现了一些具有PCa特异性的DNA甲基化位点。

孙英丽博士的课题组则从Y染色体考虑，因为Y染色体与男性性别特异的疾病息息相关。此前有报道称Y染色体上Yp11.2的拷贝数缺失与PCa中的TSPY基因簇相关，而表观遗传修饰与PCa的关系则未明确。于是Y染色体+DNA甲基化，则成为研究组的关注点。

孙博士的工作主要分两部分，第一部分是从癌组织和癌旁正常组织（NA）的对比中找到6个差异甲基化位点；第二部分是采用尿液检测的方法，进一步从这6个位点中筛选出具有无创诊断价值的1个位点。

 差异甲基化位点的初步筛选

课题组选取了66位PCa患者，并有意使样本涵盖各种情况，例如抽烟与否，肥胖与否等等，来观察甲基化模式与这些背景是否具有相关性。接下来采用染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）、基因组测序及DNA甲基化微阵列来检测Y染色体上DNA甲基化模式与PCa的关系。

其中，在5对样本中用ChIP-seq检测H3K4me3修饰的情况，未发现PCa组织与NA组织中的差异，否定其作为生物标志物的可能性。

接着，采用DNA甲基化微阵列来检测Y染色体的甲基化水平，这回便得到了可喜的结果，PCa组织中有许多位点的甲基化水平都表现出了明显差异。通过主成分分析（PCA）可以明显看到，NA聚在了一起，表明它们的甲基化模式是相似的；而PCa组织则具有异质性，且与NA有明显的区别，说明Y染色体的甲基化模式是具有PCa组织特异性的，假设得到了初步证实（Fig3. A）。

再进一步通过Wilcoxon秩和检验，确定了37个差异甲基化位点（Fig3. B），从热图中也可看出这37个位点在PCa和NA中具有明显的差异。

Fig 3 癌组织与癌旁组织的甲基化模式有明显区别

但37个位点还是太多了，不可能都用来做生物标志物。于是课题组再次分析了这66个NA样本中的Y染色体甲基化水平，发现有些位点是不稳定的，可能是易于受环境影响，这也不能用做生物标志物。所以只选择了稳定存在的保守位点，这些位点有75个。

Fig. 4 癌旁组织中Y染色体的甲基化模式

把那37个在PCa组织中有差异的位点，和75个NA中保守的位点做个交集，关注范围就缩小到了6个（具体情况如Fig. 5 B）。

Fig. 5 六个差异甲基化位点

将这6个位点在66对样本中对比观察，可见NA组织的甲基化水平相近，而PCa组织的异质性较大，二者有着明显的不同（下图蓝色为NA组织，红色为PCa组织）。

Fig. S3 66对样本中6个位点的甲基化水平

接着对患者做了背景分析，发现这6个位点的表达模式跟年龄、PSA水平、临床分期等特征的相关性并不大，也就是说，这6个位点用来做前列腺癌诊断的生物标志物具有普适性。

考虑到之前有过报道说，DNA序列的改变（SNP）也会影响甲基化水平，研究组对此潜在影响也进行了排查。对66对样本进行了全基因组测序，并没有发现PCa组织中有明显的突变。在所有样本中，那6个选中的甲基化位点也都没有发生突变。

至此已经基本可以确定这6个甲基化位点作为前列腺癌诊断的生物标志物了，再做点临床实验绘制ROC曲线，找到比PSA好一点的就行了。

可是等等！这时合作的临床医生提出了一个很重要的问题：你都取到癌组织了，干嘛不做病理？所以还要找到无创或微创的方法才行呀~

 寻找无闯检测方法

于是研究组想要在尿液中进行检测，并选择了β值（即甲基化水平值）最高的三个位点为验证对象。

课题组前瞻性收集了135份尿沉淀物样本（取样前需进行前列腺按摩，以获取足够的前列腺液和前列腺细胞，并留取100ml前段尿）。然后用焦磷酸测序检测了135份样本中的cg05163709甲基化水平和76个样本中的cg27539833甲基化水平，cg14466580未检测到。

经过病理活检，区分出PCa阳性与阴性的两组样本，可看到两个位点各自在阴性与阳性两组中的甲基化水平都有明显差异（Fig.7 A）。再绘制ROC曲线与PSA的ROC曲线，比较曲线下面积（AUC），cg05163709是0.915，PSA是0.769，尿液检测完胜。（Fig. 7 B）。

Fig. 7 两个位点甲基化水平的诊断效率

这个成果于2015年发表在Oncotarget上，技术已经获得了国内专利，去年转让给了一家生物技术公司。目前正在补充实验样本以满足CFDA的上市要求。完美转化~

实验组正在开发检测血浆的升级版，可给患者提供多种选择，期待ing~

参考文献：

Identification of specific DNA methylation sites on the Y-chromosome as biomarker in prostate cancer