作者：米粒儿
转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台
减肥，几乎成为国民话题。作为一个科研狗，出于好奇我最近翻阅了一些肥胖研究相关论文，发现了下边这篇近期发表在Nat Communications上的论文。
题目：Endotoxemia-mediated activation of acetyltransferase P300 impairs insulin signaling in obesity （回复170817可下载，一周有效）
不看不知道，一看吓一跳，为了揭示清楚肥胖的分子机制作者实在够拼，光动物模型就用了2个，绕晕了我才看懂。本文难懂主要由于作者设计了一条很长的通路，其中以乙酰转移酶P300为中心，上游设计了LPS和IRE1-XBP1通路，下游设计IRS1/2和胰岛素通路。论述中穿插直接作用机制和间接作用机制。
文章的主要结论如下：
LPS诱导内质网应激和乙酰转移酶P300蛋白表达；
在高脂饮食喂养和基因型肥胖的ob/ob小鼠模型中，P300从肝细胞的细胞核转移至细胞质中；
LPS也可通过内质网应激感受分子IRE1活化转录因子XBP1，导致P300表达升高，反过来乙酰化IRS1/2，抑制其与胰岛素受体的联系，破坏胰岛素通路；
通过药理学作用抑制乙酰转移酶P300活性可提高胰岛敏感性降低多糖症。
下边我们看一下本文主要内容
1、肥胖小鼠中乙酰转移酶P300蛋白表达升高
高脂，西式的饮食习惯是糖尿病和肥胖症的主要诱因。高脂饮食喂养2周后，小鼠产生胰岛素抗性，并且葡萄糖产量升高 (Fig. 1a–c)。乙酰转移酶P300和CBP是肝葡萄糖生产重要的调节因子，所以作者测定了高脂喂养小鼠体内P300和CBP的蛋白含量。在高脂喂养一周后产生胰岛素抵抗之前，P300蛋白水平显著增加 (Fig. 1d)。
2、在肝细胞中，LPS诱导乙酰转移酶P300表达
当采用HFD饲养CD14敲除小鼠后，P300蛋白表达水平不变，并且葡萄糖产量也不受影响（Fig.2a）。
由于HFD饲养导致血液中LPS水平升高2-3倍并且LPS通过CD14/TLR4通路引发炎症，作者连续四周观察HFD饲养后测定小鼠肝内LPS水平，发现在HFD处理两周后，LPS水平达到最高（Fig. 2b）。
接下来，作者研究LPS和P300的关系，LPS处理Hepa1-6细胞后增加P300蛋白表达量并引起内质网应激。C57BL/6小鼠腹膜内注射LPS后也有显示的实验结果（Fig2c,d）。
然后，作者测定LPS处理后，Hepa1-6细胞中P300的泛素化水平。结果表明LPS处理后泛素缀合P300水平下降，而P300蛋白表达水平上升（Fig. 2e），表明LPS通过降低泛素化和降解调节P300表达。P300是主要的核蛋白，但是在高脂饲养和ob/ob小鼠中P300主要位于肝脏的细胞质中（Fig.2F）。
在未处理的细胞中，P300定位于细胞核，但是LPS处理可导致其向细胞质转移（Fig. 2h, i）。
3、IRE1-XBP1通路活化导致P300表达升高
在上一步实验中，作者发现LPS可诱导P300表达并引发内质网应激效应。因此接下来作者试图探讨P300表达上升是否通过内质网应激效应而产生。采用毒胡萝卜素或者衣霉素在Hepa1-6细胞诱导内质网应激，发现该模型中P300表达水平明显上升，且P300表达升高晚于内质网应激发生（Fig.3a）。化合物TUDCA处理可减轻毒胡萝卜素诱导的内质网应激效应（Fig.3b）。
作者发现采用shRNA敲除XBP1后，P300的表达不再升高。而且高脂饲养的XBP1特异性敲除小鼠模型中，可有类似的实验结果（Fig.3d,e）。相反的，过表达XBP1后，P300表达水平升高，且与XBP1的浓度呈正向相关（Fig.3f）。
以上数据表明，IRE1-XBP1s通路的活化诱导P300表达。进一步的，延长高脂饲养时间可导致肝细胞中XBP1s蛋白水平升高（Fig.3g）以及XBP1s下游靶基因（ERdj4和p58ipk）的mRNA水平（Fig.3h）。
接下来作者主要测试低表达的XBP1s是否影响胰岛素通路，结果显示XBP1s过表达降低胰岛素刺激导致的AKT和GSK磷酸化水平升高（Fig.4a）。而且在肝组织中胰岛素敏感性被破坏之后，XBP1s表达升高3倍（Fig.4b）。XBP1s过表达的小鼠中分离的原代肝细胞可产生更多的葡萄糖（Fig.4c）以上结果表明XBP1s是胰岛素信号通路的负调节因子。
由于高脂饲养在肝细胞质中增加P300蛋白水平，同时内质网应激可增加细胞质和细胞核中P300蛋白表达水平（Fig.4d）。采用Far-western blot实验证明P300可直接结合XBP1s（Fig.4e）。那么XBP1s是影响细胞质内P300表达，还是细胞核内P300表达呢？为了回答这个问题，我们在Hepa1-6细胞中过表达FLAG-Tagged-XBP1s，结果发现在XBP1s过表达细胞中，定位于细胞质的P300更多。
4、在肥胖症中P300干扰胰岛素通路
内质网应激活化影响胰岛素通路，而LPS可诱导内质网应激，因此本文检测了LPS对胰岛素通路的影响。LPS处理显著降低胰岛素诱导的AKT和GSK3磷酸化，并且呈现剂量-效应关系（Fig.5a）。但是P300缺失可显著性的增强胰岛素诱导的AKT和GSK3磷酸化水平（Fig.5b,c），说明P300是胰岛素通路特异性负向调节因子。
为了检测P300是否对胰岛素敏感性产生影响，作者对采用HFD饲养小鼠两周后敲除P300，敲除后血糖水平显著降低。在高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验中发现P300缺失并不影响基础葡萄糖代谢比例，但是葡萄糖灌注水平明显上升。同时P300缺失增强了胰岛素对HGP的抑制作用，说明HFD饲养小鼠胰岛素敏感性增强（Fig.5e）。
此外，主成分分析证明P300缺失可显著性改变肝的转录组（Fig.5f）。火山图结果表明827个与葡萄糖，脂质代谢相关的基因mRNA水平显著改变。
5、抑制P300乙酰转移酶活性促进胰岛素通路
接下来作者主要探讨P300乙酰转移酶活性是否可抑制胰岛素通路。为了验证该假设，作者首先采用CBP/P300乙酰转移酶抑制剂姜黄素处理Hepa1-6，处理后AKT和GSK3磷酸化水平随着姜黄素剂量增加而升高（Fig.6b）。而采用P300乙酰转移酶特异性抑制剂C646处理后，与非活性化合物 compound 37相比，无论胰岛素是否存在，AKT和GSK3磷酸化水平也显著性增加（Fig.6c,d）。此外，C646显著性降低葡萄糖的生成量。
为了进一步评估C646对是否可以增强胰岛素抵抗动物体内胰岛素敏感性，作者在高脂饲养小鼠体内注射C646两周。结果显示C646可显著性增强胰岛素敏感性和葡萄糖耐受（Fig.6f,g）。而且C646可大幅降低IRS1和IRS2的乙酰化水平，并增强IRS1和IRS2的磷酸化水平，以及AKT和GSK的磷酸化水平（Fig.6h）。
C646处理8天，小鼠体内血糖含量降低50%（Fig.6i）此外，C646处理可增加PI3K活性，提示IR或者其硫酸盐可能是P300的靶点。C646处理可导致IRS1和IRS2迁移滞后（Fig.6k），这一过程常常和蛋白磷酸化相关。接下来，我们将IRβ和IRS1，IRS2进行免疫沉淀然后测定磷酸化水平。
结果显示C646能显著增强IRS1和IRS2的磷酸化水平，但是对IRβ磷酸化水平几乎无影响（Fig.6l）。此外，在肝组织裂解物中，IRS1和IRS2可与P300共沉淀，而IRβ则不行（Fig.6m）。由以上结果，作者认为肝组织中P300乙酰转移酶活性是C646的主要靶点。
6、P300通过乙酰化IRS1/2干扰胰岛素通路
之前研究结果表明HFD饲养导致P300迁移至细胞质中，并且C646可增强IRS1/2磷酸化水平并且IRS1/2与P300表达相关。我们推测，这些结果可能是由于P300乙酰化细胞质IR1/2蛋白产生的。为了验证这一结论，作者采用质谱的方法寻找到IRS1和IRS2的乙酰化位点。为了验证这些位点乙酰化是否与胰岛素通路相关，将IRS1和IRS2突变，单位点突变后对AKT和GSK磷酸化影响较弱（Fig 7a-d），但是多位点同时突变可增强胰岛素通路活性（Fig 7e-f）。
在体外乙酰化实验中，IRS1-triKR突变和IRS2-Dkr突变显著性降低P300调节的IRS乙酰化，IRS1/2-panKR突变也有相似的结果（Fig.7g,h），以上结果说明IRS1/2的乙酰化位点是P300靶点。而且，转染IRS1-triKQ突变可显著性的降低胰岛素引起的AKT和GSK磷酸化（Fig 7i,j）。
为了进一步确定小鼠体内IRS1/2乙酰化对胰岛素敏感性的影响，作者构建突变体腺病毒并将其注射进高脂饲养小鼠体内。结果显示注射IRS1-panKR突变病毒后，胰岛素敏感性显著升高（Fig.8a）。而IRS1-triKR突变也可增强胰岛素敏感性（Fig.8b）。在高脂喂养小鼠中敲除IRS1/2后检测IRS1/2突变对胰岛素通路的影响结果显示IRS1-triKR，IRS2-Dkr或者IRS1/2-panKR显著性增强胰岛素敏感性（Fig.8c）。
7、IRS1/2乙酰化降低其与IRβ的联系
在肥胖小鼠模型中（ob/ob mouse），作者发现肝P300蛋白水平和IRS1/2乙酰化水平都呈现显著性升高（Fig.8d）。然而ob/ob mice中IRS1/2与IRβ的关系较弱，这说明IRS1/2乙酰化可能影响其与IRβ的结合。为了验证这一假设，作者采用C646处理Hepa1-6细胞，并且进行免疫沉淀实验。结果表明C646可显著增强IRS1/2与IRβ的联系（Fig.8e）。此外C646可显著性增强高脂饲养小鼠中IRS1/2与IRβ的联系。
此外为了直接证明IRS1/2乙酰化降低其与IRβ的结合，我们采用Far-western blot实验，其中纯化的IRS和突变IRS含量相似。KR突变的IRS1/2可增强与IRβ关联，相反乙酰化的IRS1减弱其与IRβ的作用。
参考文献：Endotoxemia-mediated activation of acetyltransferase P300 impairs insulin signaling in obesity
联系客服
