T细胞活性检测，六大妙招全get√

作者：子非鱼

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众所周知，T细胞家族这个名门望族的子弟繁多，亚型也是不一而足，如Th1、Th2、Treg、Th17等；加之膜结合受体研究技术的局限性，因而想将发现T细胞的庐山真面目确实存在一定的困难。

好在研究者们凭着多年与T细胞家族打交道的经验，总结出六大妙招，可让弥漫在T细胞反应之上的浓雾吹散几分。常言道，万变不离其宗，六大招式虽各有千秋，但总归离不开以下两种类型方式来检测T细胞对刺激的反应性。

1）分析T细胞特征性反应，如细胞因子分泌等

2）分析T细胞表面的特异性受体。

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限制稀释培养法

 该技术主要是通过T细胞的各种稀释液测量对特定抗原产生活化反应的T细胞比例，并测量T细胞反应呈阴性的微孔数目。

无需太多数学模型，但在短时间内，每个孔中活性T细胞的分布应遵循泊松分布（因为这些细胞应该是随机分布的），进而可利用这些信息来计算活性T细胞的数量。更多相关数学知识，可查看此网站http://www.biology-pages.info/L/LimitingDilution.html

而从泊松分布中可知如果反应阴性孔的比例为37％，则每孔平均有一个抗原特异性T细胞。

那么在读出产生37％阴性孔的细胞数后，就可计算出活化T细胞的比例。比如，每孔细胞接种5000细胞产生了37％的阴性孔，则活化T细胞比例为1/5000。而当小鼠获得免疫后，该比例应该会增加，表明抗原促进了T细胞增殖。

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ELISPOT

 然而，如果你若要进行更详细的研究，如T细胞表型等，有限的稀释培养法是相当费力的。此时，ELISPOT（酶联免疫斑点，一种ELISA衍生技术）则通过检测细胞因子产生来间接反映出活化T细胞的类型。

简言之，在用非反应性血清进行封闭前，先通过单克隆或多克隆抗体涂覆PVDF（聚偏二氟乙烯）微孔板，并将T细胞与刺激物一起培养，以活化T细胞来分泌细胞因子。随后细胞因子可被包被于微孔表面的抗体所捕获。 

接下来，就需要洗涤平板以除去细胞碎片、未结合的抗体和培养基，再加入与发色（着色）底物（通常是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）偶联的第二抗体。

在显色反应的作用下，细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数。

其中，1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌该蛋白或者细胞因子的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）。

尽管ELISPOT要比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。但该法确实也具有自己的缺点，因为其在描述单细胞的细胞因子分泌谱时仍然受到限制。此时，我们仍可通过细胞内染色法在单细胞水平体现出细胞因子分泌情况。

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细胞内染色

在做细胞内染色时，需要先用蛋白质转运抑制剂(如Monensin或Brefeldin)来抑制细胞因子的分泌，可使新产生的细胞因子滞留在细胞内；而后通过破膜剂来使荧光抗体进入细胞并特异性标记细胞内相应抗体，最后以流式细胞术来检测并分析相应细胞因子以及细胞的质和量但这种方法有一个缺点，就是细胞在被4%多聚甲醛固定的过程中就已经死亡了。

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细胞因子捕获

 而另一种替代细胞内染色的方法也能克服了ELISPOT的问题，即通过双特异性抗体（Bispecific antibody,BsAb）来捕获细胞因子。

双特异性抗体作为抗体界的新贵，可将两种不同抗体的重和轻链对结合，因而拥有者两种特异性抗原结合位点，其中一个靶向T细胞的表面标记，如MHC，而另一个则靶向特定的细胞因子。 

所以双特异性抗体可在靶细胞和功能分子之间架起桥梁。在用蛋白质转运抑制剂处理活化的T细胞后，再用双特异性抗体结合并激活T细胞，如果T细胞分泌特定细胞因子，那么与细胞表面结合的混合抗体就能捕获这些细胞因子，而后用一种带有标记的第二抗体来检测细胞因子即可。

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四聚物染色

 T细胞的反应也可以通过其表面受体TCR的特异性来测量，比如使用荧光标记的特异性MHC:肽四聚物。

由于可溶性MHC单体分子与TCR的亲和力很低、解离快，而多价分子可与一个特异性T细胞上的多个TCR结合，使其解离速度大大减慢。为此，可通过生物素-亲和素级联反应放大原理构建MHC类四聚体。

即通过基因工程技术将生物素酶底物肽加到MHC类分子重链的羧基端而形成融合蛋白，并在体外按一定比例与β微球蛋白及特异性抗原短肽共孵育，折叠成正确构象后形成pMHC。

将生物素标记在底物肽的赖氨酸残基上，使得一个标记荧光素的链亲和素与四个生物素标记的pMHC复合物结合形成四聚体。当该四聚体与T细胞表面的特异性TCR结合后，即可通过流式细胞仪进行定量检测分析。

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谱系分析和生物传感器的检测

T细胞群的多样性可以通过谱型来定义。先通过凝胶电泳可视化CDR3区域来比较表达相同V段的受体。而后通过Biosensor来测量配体与其互补的抗原受体之间的结合和解离率。

其中，待测试的配体是固定在镀金表面上，可溶性T细胞受体在与该配体结合一段时间后在洗涤的条件下可发生解离，而结合和解离的过程可用生物传感器进行实时测量。

生物传感器的测量原理在于分子间的相互结合可影响玻璃芯片表面的一个偏振光源的全内反射，进而可通过反射光的角度及强度变化来检测镀金玻璃芯片表面分子的结合能力并分析出结合率和解离率，可形成随时间变化的“传感器图”。

当然，受体也可固定在镀金表面上。当系统处于饱和状态（即结合与解离之间处于一种平衡状态）时，图线将趋于平稳，表示饱和受体将不再与配体相结合。

此时通过洗涤可将未结合的分子洗去，在继续洗涤后，已结合的配体均将与受体发生解离，而后相互作用的测量曲线会开始下降，显示解离发生的速率。 

参考资料：http://bitesizebio.com/22831/six-ways-to-measure-t-cell-responses/