作者：米粒儿
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国庆前更新的文献精读第四讲内含子老师主讲呼吸免疫研究套路。选取2017年4月发表在Nature的参考文献。
文献中文题目：肺是生成血小板和协助造血的重要器官。大家知道一项科研成果能够发表在CNS级别期刊已是研究领域翘楚，而能够引起媒体广泛关注的研究成果可谓凤毛翎角。
本文便是其中之一，一经发表便引起了全球各大媒体争相报道，有媒体称文章中的发现达到了足以修改教科书的水平。从标题可以看出这篇文章有两个主要内容：1、大量的血小板是在肺部生成的；2、肺内存在造血干细胞，具有一定造血功能。
结果总览
这篇文章正文中有4个结果图，这四个图具有一定的逻辑关联性。其中图1是肺毛细血管的发现，发现肺巨核细胞中有大量的血小板，这和本文的科学假说是完全吻合的。
同时作者发现，肺的巨核细胞来源于骨髓主要存在于骨髓间质中。借来下作者提出一个问题，肺的间质中会不会像骨髓一样存在巨核细胞呢？于是有了图2结果，证实肺间隙内存在着固有巨核细胞并且对巨核细胞的生物学特性进行鉴定。
图3作者主要回答肺间质巨核细胞是否具有再造血小板的能力。发现肺源性祖细胞在血小板减少性小鼠中可改善血小板数量和造血干细胞缺乏。既然能改善造血干细胞缺乏那么肺是否含有造血干细胞呢？图4主要回答了这个问题，发现肺内含有造血干细胞，其中包括巨核细胞祖细胞。
数据解析
下边进入数据解析环节，深入研读本文数据说理过程。首先进入图1，图1a和b是采用双光子活体显微术观察到的巨核细胞在肺毛细血管中形成血小板的过程。
用到的小鼠是鼠A（PF4-mTmG），它的特点是巨核细胞和血小板胞膜带绿色荧光，肺毛细血管细胞胞膜带红色荧光。从左到右可以看出随着时间推移，肺巨核细胞释放出多个血小板，在图b中虚线圈出的是巨核细胞胞核的位置。
图c-k为大家展示了巨核细胞和血小板的形态特征。其中图c为显微镜下图像，绿色荧光是巨核细胞和血小板。图d是二者的体积，图e是二者的直径。图f是巨核细胞生成血小板的数量。
图g显示0.07mm3肺内每小时存在2个巨核细胞。图h表示每小时肺可生成一千万个血小板。图i说明肺生成血小板的量占全身的50%。图j&k说明血小板生成素可促进外周血和肺部血小板的生成。
图l展示了巨核细胞释放血小板的前体进入血窦过程。我们可以看箭头指向。
图m表示巨核细胞定植于骨髓间隙内。其中虚线圈出的巨核细胞胞核的位置。
观察完肺毛细血管内巨核细胞的动态变化，下边来看图2肺间隙内的固有巨核细胞特点。图a-c是对3种小鼠肺巨核细胞的观察。
这3种小鼠分别是鼠C：PF4 -tomato (巨核细胞和血小板+全身其他细胞），鼠A：PF4 -mTmG (巨核细胞和血小板膜 +全身其他细胞膜），鼠B：PF4 -nTnG nTnG (巨核细胞胞核+全身其他细胞核）以上文字颜色与下图中荧光相对应。
通过这三幅图可以发现在肺间质内存在着固有巨核细胞。图d描述了巨核细胞的体积和直径。
图e显示了巨核细胞数量。图f&g是将固有巨核细胞胞核和其他肺间质细胞胞核进行比较，发现巨核细胞胞核巨大且具有不均一性。
图h是将肺间质巨核细胞分选出来进行荧光染色，蓝色为胞核，绿色为血管性血友病因子，结果显示巨核细胞为血管性血友病因子阳性。
接下来，作者在图I中巧妙的设计了一个实验，检测了巨核细胞在肺毛细血管内和肺间质内的分布比例。实验中用到的小鼠巨核细胞被染成红色。CD41是巨核细胞的特异性标志物。
通过实验设计后血管内巨核细胞可染上FITC和APC两种颜色，而肺间质内巨核细胞只能染上FITC一种颜色，这样流式细胞仪可以将两种细胞分开。统计结果见图j，血管中的巨核细胞占所有巨核细胞的15%。而肺间质巨核细胞占85%。
接下来作者将巨核细胞标记出来，对一些表面标志进行染色，如下图所示。发现肺间质巨核细胞和骨髓中巨核细胞表面标志物一致。图l和m显示的是肺骨髓和外周血细胞中巨核细胞数量的比较发现巨核细胞主要存在与肺和骨髓中，外周血中含量很少。
在图上中作者检测了存在于于肺间质的巨核细胞是否具有血小板的再生功能。图a是实验设计方案。采用的小鼠有两类，鼠C：PF4-tomato (巨核细胞和血小板+全身其他细胞），鼠E：c-mpl-/-(无荧光，血小板减少症）。
图b是外周血中血小板的变化情况，在阳性对照和阴性对照中间的红色的线是实验组，随着时间的推移，血小板的数量逐渐增加且在第90天与阳性对照数量基本相同。从而说明巨核细胞具有血小板再生能力。
图c和d的流式结果也说明了同样的结论。图e和f是移植三个月后骨髓内检测到含荧光巨核细胞的数量和图像。
为方便理解后续结果图，我们首先回顾一下造血干细胞发育基础理论知识。作者接下来要检测肺移植后对造血干细胞及巨核细胞总细胞的影响，用流式检测后一共看了两个指标，一个是巨核细胞总细胞占髓系祖细胞MP的百分比。另外一个是长期造血干细胞LT占LSK细胞的百分比。
这一部分实验使用的肺移植模型是鼠D：mTmG小鼠（全身带有红色荧光）的肺移植到血小板缺少症小鼠（鼠E）体内。对造血干细胞进行抗体标记。图g显示巨核祖细胞占髓系祖细胞MP的百分比，三个图分别是供体鼠，受体鼠和移植后的结果。
移植后Mkp百分比几乎恢复到供体鼠的正常水平。图h是g的统计结果图。图i和图j检测带荧光的MkP占总MkP的百分比，发现移植后受体鼠体内的MkP有一部分来自供体鼠。
图k和l显示的是长期造血干细胞LT占LSK细胞百分比。我们发现移植后长期造血干细胞LT的百分比明显上升。图m和n显示大约一半的LT都带有红色荧光来自与供体鼠。
既然肺内的细胞具有重塑骨髓的作用，那肺内一定存在着造血干细胞。图a-d将WT鼠中肺部与骨髓内LSK和MP各亚群的数量及百分比进行对比。图a肺内细胞标记结果，图c是骨髓标记结果。
共检测5个干细胞亚群，分别是多功能干细胞3/4（MPP3/4）,多功能干细胞2（MPP2）,短期造血干细胞（ST），长期造血干细胞（LT），巨核细胞总细胞（MkP）。发现肺内各细胞比例和骨髓内各细胞比例非常相似。
e图显示的是肺和骨髓内LSK的形态非常相似。既然数量和形态都相似，那么是否具有相似的功能呢？f是实验方案将正常小鼠肺内的LSK细胞和ST细胞分选，回输到具有血小板减少症的小鼠体内定期检测外周血中血小板的数量。
g-i是外周血中血小板数量的检测。结果显示正常小鼠的LSK和ST细胞均能提升血小板数量，而且与骨髓来源的细胞相比，提升力度几乎无差别。
以上就是正文中的所有实验结果。下边对实验结果进行一下总结。
本文分别从肺毛细血管和肺间质两个部位进行研究。在肺毛细血管内发现骨髓和脾内的巨核细胞和血小板前体进入血液，随血液循环到达肺部，在肺毛细血管内释放血小板。
在肺间质内，造血干细胞和巨核细胞祖细胞可回迁入骨髓，参与骨髓重建，行使造血及制造血小板的功能。
套路分析
下边进入套路解析部分，本文用到的实验方法比较前端，例如双光子活体显微术，各种敲基因小鼠，在普通的实验室内几乎无法达到。因此照搬文章中的实验套路几乎不可取，但是根据这篇文章的实验结果，可以提供新的课题思路和方向。
针对奋战在一线的临床科研工作者们，由于奋战在一线对基本实验技术掌握相对薄弱。推荐大家学习统计方法，发表临床研究相关论文。
接下来就以呼吸内科，胸外科，肿瘤科和血液科为例，看看我们读了这篇文章之后能做什么，既然这篇文章发现肺部对血小板的生成如此重要，那么在肺部发生病变和损伤后，患者的血小板数量和功能用没有改变呢？
胸外科和肿瘤科也可以采用相似的思路。而对于血液科，则可以考虑雾霾，吸烟等因素与血液病的流行病调查。
解螺旋2017文献精读秋季班开设答疑环节，本周六（10月14日）晚上8点到9点内含子老师将就以上内容为学员们进行答疑。
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