作者：米粒儿
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上周更新的文献精读秋季班第七讲由Dylan老师主讲肿瘤转移研究套路。选取文献来自于Nature子刊，Nature medicine，2016年影响因子为29.885。
文献中文题目：肺癌转移研究揭示了一个可靶向通路：CD109-Jak-Stat信号通路
首先我们看一下本文的科学假说，如下图所示：CD109通过与Jak-State3信号通路相互作用导致下细胞迁移能力增加，沉默CD109或者抑制Jak激酶家族，可抑制肺癌转移。
文章背景
在文章背景中，作者主要指出来常用的细胞水平，组织水平实验的局限性和不足。细胞水平研究，无法反映肿瘤生长的原生环境中的全部分子特征。而肿瘤原发灶及转移灶组织标本的分子分析难以反应肿瘤细胞水平的分子改变。
提出局限性后，作者提出了一个新的研究工具-等位基因控制的小鼠模型，该模型可以诱导肺腺癌和胰腺癌发生，并可实现癌症分阶段研究，克服了细胞水平和组织水平实验的局限性。本文后续研究都选择了该模型。
结果总览
本文研究流程如下，首先应用等位基因条件控制小鼠模型，采用流式细胞技术分选肿瘤细胞后。分选后的肿瘤细胞，用Barcode分析鉴别发生转移的原发肿瘤细胞，并对区分早期及晚期转移的标本进行个RNA测序后，筛选出转移不同阶段的基因表达热点。之后是常规的分子功能验证流程，包括：敲减分子观测表型，体内体外实验进行机制研究两部分。
数据解构
下边我们详解结果图。图1是本文用到的方法概括。其中a图中作者对条件控制小鼠模型KrasLSL-G12D/+;Trp53flox/flox;Rosa26LSL-Tomato (KPT)，进行条码标记。从而使得肺肿瘤具有特征性条码标记，并稳定表达荧光标记。 该荧光信号有益于肿瘤转移的判断。
图b是一个代表性的图像，证明表明可进行基于流式细胞技术的肿瘤细胞分离纯化。
图c肿瘤细胞分析情况统计，对肿瘤细胞进行分离情况以及条码扩增及测序的肿瘤数目进行统计。
图b和图c分别对肿瘤细胞进行分析，并对肿瘤细胞分析情况进行统计。这两步的主要目的是鉴别转移/非转移的原发灶细胞。在图d中通过Barcode鉴别转移/非转移的原发灶细胞。
图e是所有受试小鼠原发灶与转移灶肿瘤分析情况的统计。其中31例发生转移（黑色实心环形）、149例非转移（黑色空心环形）。每只小鼠的转移瘤数目远远高于被分析的肿瘤数目（浅灰色空心环形）。
在27只小鼠中，发现转移来自于大于等于1个原发肿瘤。23只发生转移的小鼠中，所有转移均来自于同一原发肿瘤。4只小鼠中，转移具有2个特异性条码标记，也发现了相应的2个原发肿瘤（有2个黑色实心环形的小鼠）。
图f是早/晚期肿瘤进行RNA测序情况统计。基于RNA测序的基因分析范例。KT-Late 样本是来自于小KrasLSL-G12D/+;Rosa26LSL-Tomato (KT) 肿瘤发生6–7 月后的肿瘤组织。KPT-Early (KPT-E) 样本是KPT小鼠肿瘤发生10周后的肿瘤细胞。
图2主要是检测转移进程中，肺肿瘤的基因表达程序也经历阶段性改变。图a是对所有样本分组：KT /KPT-E、TnonMet/TMet 、almost all (>90%) metastases（ Met ）。分组后对基因表达进行聚类分析。结果显示： ①KT /KPT-E、TnonMet、Met三组间差异明显②TnonMet/Tmet一致性较高；③部分Tmet与Met具有一致性。
图b是对淋巴结、胸膜、肝脏、软组织，进而分组对基因表达进行聚类分析。结果显示不同组织器官间转移灶基因表达差异性不显著。
图c对样本进行分组：KT /KPT-E、TnonMet/TMet （与图a一致）。分析KT /KPT-E与TnonMet/Tmet两组间稳定及保守的基因表达差异（>2倍差异， P < 0.01 ）。结果显示了不同转移阶段的基因表达差异性。
图d对样本进行分组：TnonMet及Met （与图a一致）。分析TnonMet及Met两组间稳定及保守的基因表达差异（>2倍差异， P < 0.01 ）。结果显示了转移及无转移组织间的基因表达差异性。
图e热图结果显示转移和肺转移原发灶之间的基因表达差异性显著。
图f和图g分别是非选择性肺腺癌患者和突变肺腺癌患者的生存分析。分析非转移灶/转移灶基因表达进行统计。基因表达特征谱低时，生存情况好，表达高，生存情况较差。
图3主要通过体内功能筛选确定CD109具有转移驱动能力
图a和图b是筛选候选基因，依次稳定敲低每个候选基因，比较对转移能力的影响。发现CD109敲低后，转移能力降低最明显。
图c是荧光分析的代表性图像。shCd109与shControl对比，对肺转移的影响。Cd109敲低后，转移能力下降。
图d，e和f是采用皮下成瘤模型验证CD109与转移关系。shCd109与shControl对比，对肺转移、肝转移的影响。比较肺转移区域、肝转移数目。再次确认，Cd109敲低后，转移能力下降。
图4主要证明CD109调控Stat3活性，进而驱动恶性细胞表型及转移能力
图a和图b中Cd109敲低或敲除，可导致磷酸化Stat3减少。Cd109表达升高，可导致磷酸化Stat3增加。
进一步的，作者检测了一系列肺腺癌细胞系中CD109和Stat3磷酸化水平。发现Cd109表达越高，磷酸化Stat3越高。
接着作者选用克隆生长和迁移实验两个典型的表型实验，分别对shCon组，shStat3组和shCD109组进行检测，结果显示敲低Stat3/ Cd109，克隆生长及迁移能力降低。
皮下成瘤的体内实验也证明，敲低Stat3，肺转移、肝转移减少。
图5主要证明CD109通过Jak-Stat3信号通路发挥作用。图a中高度活性的Stat3/与GFP对照组；分别接受shCd109与shControl处理。结果显示：高度活性Stat3，克隆生长及迁移能力升高；高度活性Stat3可保存因敲低Cd109导致的克隆生长及迁移能力降低。
图b是荧光成像结果。表明高度活性Stat3可提高因敲低Cd109导致的肺转移减少。
动物实验结果也表明高度活性Stat3可提高因敲低Cd109导致的肺转移、肝转移减少。
而在Cancer cells from a KPT mouse (889 cells，g，h，i)和Human lung cancer cell line (H460，j)中，抑制Jak家族激酶，降低Stat3磷酸化，与敲低Cd109导致的Stat3磷酸化降低相似。
套路解析
而在Cancer cells from a KPT mouse (889 cells) 及Human lung cancer cell line (H460)中，抑制Jak家族激酶，克隆生长及迁移能力降低。与敲低Stat3及Cd109导致的克隆生长及迁移能力降低一致。以上实验结果证明了Jak-Stat3信号通路是CD109关键的促转移因子。
在图5的基础上，作者通过建立皮下成瘤模型，接受Broadly acting Jak kinase inhibitors (pyridone 6)处理10天或20天。发现肺腺癌细胞的转移能力被抑制，证实Jak–Stat信号通路的药理学抑制剂有治疗效果。
综上所述，作者概括了Jak–Stat介导的CD109促肿瘤转移机制。CD109通过与Jak-State3信号通路相互作用导致下细胞迁移能力增加，沉默CD109或者抑制Jak激酶家族，可抑制肺癌转移。
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