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Nature发文，你还没有开始用3D肿瘤细胞培养吗？
癌症是人类面临的一个重大问题，在世界范围内，每年会有上万人因癌症而失去生命。科学家们一直以来都在努力认识癌症的发生、发展过程，期望能从中找到癌症的弱点，实现有效治疗。进入21世纪以来，CRISPR技术的兴起及其衍生的，在基因组范围内进行CRISPR筛选的技术（Box.1）被广泛应用，癌症基因组学应运而生。目前，人们已经通过CRISPR筛选获得了大量潜在的关于致癌突变的基因信息，但仍然无法可量化地确定究竟是哪些突变会导致癌症发生。此外，在癌症研究中，模型的选择也会影响实验的结果。目前使用的转基因小鼠、异种移植模型、2D肿瘤细胞系培养和类器官模型各有优点，但也有诸多限制。
Box.1
CRISPR筛选（CRISPR screen）技术是通过构建sgRNA文库，转染到目的细胞中进行全基因组范围的敲除，随后进行细胞表型筛选及高通量测序分析，以从中找出控制表型的关键基因的技术。表型筛选分为阳性筛选和阴性筛选：阳性筛选是指筛选阳性表型（positive phenotype），即在特定情况下（例如抗癌药物处理条件）能够使本来无法存活或增殖受到抑制的肿瘤细胞变得能够存活和增殖的基因扰动，随着细胞群体中这一部分细胞数量的增多，其中的sgRNAs得到富集，获得这些sgRNAs与sgRNA文库进行比对，就可以获知控制阳性表型的基因，筛选到的基因本身等同于抑癌基因（Tumor suppressor genes，TSGs）作用；阴性筛选是指筛选阴性表型（negative phenotype），即在特定情况下能够使本来可以存活或增殖的肿瘤细胞变得不能存活或增殖受到抑制的基因扰动，随着细胞群体中这一部分细胞数量的减少，其中的sgRNAs富集度降低，因而需要与不加抗癌药的对照组进行基因组水平比较，就可以获知这些丢失的基因，筛选到的基因本身等同于原癌基因（oncogenes）的作用。
在2020年3月11日发表的一篇题为：“CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities”的Nature文章中，作者Michael C. Bassik等人将CRISPR筛选技术运用到3D培养的肿瘤模型中，从量化的角度比较了3D培养体系和2D培养体系中发现的驱动肿瘤表型的基因差异，同时从3D培养体系中鉴定出一个在2D培养中没有发现的新的治疗靶点，并进行了完善的功能验证、机制研究和临床分析。首先，作者对DepMap数据库（2D细胞系CRISPR筛选数据组成的数据库）中的数据进行分析，发现在驱动表型能力较强的前1000个基因扰动（hits）中，仅有不到1%表现出阳表型（Fig.1a），而且对一直的一些原癌基因和抑癌基因在2D培养体系中的CRISPR验证也表明，即使是针对TSG的CRISPR依然无法表现出阳性表型（Fig.1b）。因此，作者构建了3D肺癌细胞系（H23）的培养体系，并进行CRISPR筛选（Fig.1c, Box.2）。Box.2
H23细胞系是非小细胞性肺癌细胞系，其自身天然携带KRAS(G12C)突变，这是在肺癌中的一种高频突变。针对这一KRAS突变体，目前有专一性的抑制剂ARS-853，在本研究中相当于抗癌药物，作者进行的CIRSPR筛选基于ARS-853处理。
结果表明，3D培养体系或经过标准化处理的3D/2D模型中能够鉴定出更多的驱动表型能力强的抑癌基因，而在2D培养体系中无法检测到（Fig.1d, Box.3）。为了进一步证明3D培养体系与2D培养体系检测到的基因表型差异，作者基于COSMIC数据库（包含已经得到注释的原癌基因和抑癌基因的数据库）中的数据进行分析，发现只有在3D培养体系中，才能观察到抑癌基因和原癌基因进行CRISPR后的驱动表型差异，而在2D培养体系中，对于原癌基因和抑癌基因的CRISPR并没有引起相反的表型变化（Fig.1e）。Box.3
在Fig.1d中，横坐标gene effect（pZ）是指基因驱动表型效果的能力大小，通过对sgRNAs在实验前后的富集倍数取对数，即pZ = log2(sgRNAs富集倍数)，并以对照组进行标准化后进行计算。阳性筛选中sgRNAs富集增多，富集倍数 > 1，则pZ > 0，获得抑癌基因列表；阴性筛选中sgRNAs富集降低，富集倍数 < 1，则pZ < 0，获得原癌基因列表。纵坐标phenotype score（T-score）是指表型变化的强度，通过pZ进行折算。T-score > 0，代表阳性表型，即细胞存活和增殖；T-score < 0，代表阴性表型，即细胞无法存活或增殖抑制。当pZ值越大，同方向上的T-score值就会越大。
此外，作者将在3D培养体系中鉴定出的基因功能进行了信号通路富集分析。结果表明，3D培养体系中鉴定到的基因更多富集在与肿瘤发生密切相关的一些信号通路上，而在2D培养体系中富集到的通路有相当一部分是控制细胞基础生命活动的信号通路（Fig.1f）。从而表明，3D培养体系相对于2D培养体系更能够准确模拟肿瘤的发生，从中鉴定出的基因更可能是驱动肿瘤发生的相关基因。
Figure 1：3D培养体系中全基因组范围的扫描检测到更丰富的肿瘤驱动基因及其信号通路为了进一步证明3D培养体系更加符合生物体内肿瘤发生的真实情况。作者比较了在3D培养体系及3D/2D标准化模型中驱动肿瘤表型能力强的基因与已经发现的在肺癌中高频突变的基因之间的相似度。结果表明，在3D培养体系中，驱动肿瘤表型能力越强的基因，在肺癌患者中越会发生高频突变（Fig.2a, Box.4）。从而证明，作者在3D培养体系中鉴定出的基因，更加符合驱动肺癌发生的真实基因。Box.4
在Fig.2a中，纵坐标代表肺癌中已发现的基因突变的显著性，值越大代表在肺癌中的突变显著性及频率越高；横坐标是选取了3000个作者在3D培养体系中鉴定的基因，对其pZ值进行排序，越往X轴右侧，代表基因驱动肿瘤表型的效果越强。
为了更加鲜明地对比3D培养体系、2D培养体系与体内肿瘤模型的差异，作者在CIRSPR筛选中加入了小鼠体内异种移植模型，基于前面的数据选取了911个驱动表性能力强的基因的sgRNAs构建了sgRNA文库，并将所使用的细胞系扩大到10株常见的非小细胞性肺癌细胞系，进行同样的CRISPR筛选（Fig.2b）。从相关性分析的结果可以看到，3D培养体系下的T-score与体内异种移植瘤的T-score的相关性更高（Pearson corr = 0.71 > 0.45）（Fig.2c）。此外，作者同样比较了三种培养模型中筛选到的基因与肺癌中高频突变基因的相似度，结果表明，在in vivo/2D和3D/2D avg.（基因在10株细胞系中的pZ值均值）模型中，驱动表性能力越强的基因，在肺癌中对应突变频率越高的基因（Fig.2d）。综合以上的所有结果，作者表明，3D培养体系相对2D培养体系，能够更准确地模拟体内肿瘤发生的真实情况。从3D培养体系中经CRISPR筛选获得的基因更加符合真实驱动肿瘤发生的基因。Figure 2：3D与2D培养体系中的差异基因富集于肺癌中高频突变的基因谱在获得了3D培养体系中驱动肿瘤表型的基因信息，并证实3D培养体系更加符合肿瘤在体内的真实发生过程后，作者进一步探究3D培养体系中是否存在一些还未在2D培养体系中发现的潜在的治疗靶点。基于DepMap数据库中提供的基因间的表型相关性，作者将这些潜在的驱动肿瘤发生的基因按照表型进行了分组，称为模块（modules），并对3D培养体系的数据进行分析。结果表面，在3D培养体系中确实存在2D培养中没有的，体现原癌基因功能的功能模块，即羧肽酶D（Carboxypeptidase D, CPD）模块（Fig.3a）。
随后，作者对CPD模块中包含的基因进行分析，发现其中包含CPD，FURIN，ATP2C1，MET和IGF1R。基于DepMap的数据，作者分析了CPD，FURIN和IGF1R之间的相关性，表明三者之间存在一定的相互关系（Fig.3b,c, Fig.S4e,f）。为了在3D培养体系中进一步确认这一点，作者通过CRISPR-double knockout技术进一步分析了145个在3D/2D模型中驱动表型能力强的基因（包含FURIN等基因）与CPD基因的基因间相互关系（Gene Interaction）（Fig.S5a,c, Box.5）。结果表明，FURIN等蛋白确实与CPD之间存在较强的相互关系。Box.5
基因间相互作用（Gene Interaction）是指基因间的互作关系，但这种互作并不一定代表基因编码相互作用的蛋白质，或基因在同一细胞中表达，而是代表基因间存在功能上的联系。这种互作关系分为两种：阳性互作和阴性互作。阳性互作是指基因间具有增强效应，即两个基因双突变的表型影响大于预期的单基因突变的表型影响之和，通俗来说就是1 + 1 > 2的效应，合成致死性（synthesis lethal）是阳性互作的一个极端例子；阴性互作是指基因间具有削弱效应，即两个基因双突变的表型影响小于预期的单基因突变的表型影响之和，通俗来说就是1 + 1 < 2的效应。无论是阳性互作还是阴性互作，这种基因互作的强弱都用基因互作分数（Gene Interaction score, GIs）。GIs评分越高，代表基因间的相互作用越强，也就越具有相关性。
找到CPD模块后，作者进一步探究CPD模块中哪一个基因对表型的影响作用最大。为此，作者进行了竞争生长实验（Competitive Growth assay），即CRISPR后细胞增殖受到抑制最强的细胞群体中所敲除的基因具有最强的驱动表型能力。据此，作者将下面的研究聚焦于CPD模块中的CPD基因上（Fig.3d）。随后，作者使用Dox诱导的dCas9-KRAB系统对CPD基因进行knock-down，证明CPD敲降导致增殖受到抑制（Fig.S7a, Box.6）。由于CPD模块中，CPD基因与IGF1R的相关性较高，作者猜想CPD是否通过调控IGF1R信号进而控制表型。因此，作者在CPD KO模型中通过荧光检测IGF1R信号，结果表明CPD敲除组中，IGF1R及其下游的AKT，ERK信号都显著降低（Fig.3e,f），同时作者通过加入过量IGF1（IGF1R的配体）过度激活IGF1R能够回补CPD敲除导致的增殖抑制表型（Fig.S9a），最终确认CPD通过调控IGF1R信号进一步影响细胞增殖表型。Box.6
dCas9-KRAB系统中的dCas9是指对Cas9的核酸内切酶活性位点进行了突变，使其内切酶功能缺失，仅能依靠sgRNA导向定位于基因组的特定区域。dCas9与基因组特定位置的结合形成位阻效应，抑制了下游基因的转录活性。此外，还可以在dCas9上连接一个转录抑制因子KRAB，进一步增强转录抑制作用，从而实现将knock-out系统改造成knock-down系统。
Figure 3：CPD功能模块对于3D培养肿瘤细胞的增殖和IGF1R的功能至关重要Figure S4, S5：DepMap数据库数据（Fig.S4e,f）与3D培养体系中CRISPR-double knockout筛选证实CPD模块中基因间存在相互关系（Fig.S5a,c）Figure S7, S9：敲降CPD后细胞增殖受到显著抑制（Fig.S7a），加入过量IGF1过度激活IGF1R信号能够回补CPD敲除导致的增殖抑制表型（Fig.S9a）在确认CPD的控制表型的初步机制后，作者进一步对机制进行深挖，探究CPD如何影响IGF1R信号。因为CPD本身作为羧肽酶家族中的一员，能够发挥从肽链末端对氨基酸进行逐一剪切的作用，且其特异性识别精氨酸和赖氨酸。此外，由于FURIN已被证明参与IGF1R信号调控，CPD与FURIN也存在较高的相关性，且二者都定位于反面高尔基体，因此作者猜想CPD可能也参与IGF1R的成熟。作者对IGF1R的成熟过程进行分析后，发现FURIN切割pro-IGF1R的位点上游存在一个RKRR基序（RKRR motif），随后RKRR基序位于IGF1R α链的C末端，因此CPD可能发挥了移除α链C末端RKRR基序的作用（Fig.4a）。
为次，作者在RKRR基序上游插入了1D4（1D4是一个抗原表位，当其暴露于C链末端时，能够与其特异性抗体Rho1D4高亲和性地结合，产生荧光信号；当其没有暴露时，结合的亲和力较弱，荧光信号也会降低），并人为地在RKRR基序上游插入一个或者两个氨基酸（Fig.4b），随后在CPD对照组和敲除组中检测荧光信号强弱。结果表明，CPD敲除后荧光信号显著降低，且若RKRR基序上游存在其他氨基酸时，即使在CPD对照组中检测到的荧光信号也非常低，这表明CPD确实通过移除α链C末端RKRR基序参与IGF1R成熟，且这种移除作用是精确地（Fig.4c,d,e）。随后，作者在异种移植瘤中也通过竞争生长实验检测再次验证了CPD敲除后抑制细胞增殖的表型（Fig.4f,g,h），从而证实CPD在体内和体外实验中，都具有调控细胞增殖的作用，且其机制是通过移除IGF1R α链C末端RKRR基序参与IGF1R的成熟过程。Figure 4：IGR1R α链是CPD的底物且CPD缺失抑制异种移植肿瘤的生长最后，作者对CPD在临床上的预后指示性作用也进行了分析。首先，作者通过Meta分析（Fig.S10a），发现在预后较差的肺癌患者中，CPD处于高表达状态，生存曲线分析也同样证明了这一点（Fig.4i）。为了进一步确认CPD表达对预后的影响，作者引入了基因集变化分析（Gene set variation analysis, GSVA）评分（Box.7），同样发现，GSVA评分越高预示着肺癌患者预后越差（Fig.4j）。此外，由于在H23细胞系中同时进行CPD敲除和KRAS（G12C）抑制剂ARS-853处理具有致死效应，作者对CPD敲除是否会增加肿瘤细胞药物敏感性进行检测，证实CPD敲除能够增加肿瘤细胞的药物敏感性（Fig.4k）。Box.7
Gene set variation analysis（GSVA）是一种gene set enrichment（GSE）方法，以无监督的方式估计样本群体中通路活性的变化。可以简单理解为CPD表达变化所引起的下游信号通路或基因表达的影响。当CPD表达变化带来的影响越大时，GSVA评分就会越高。
Figure 5：CPD具有预后指示意义且靶向CPD能够发挥潜在的治疗作用为了进一步阐明CPD表达及其GSVA评分对预后评估的意义，作者分析了在KRAS野生型（KRAS-WT）和KRAS突变型（KRAS-MUT）肿瘤患者中的生存曲线。发现在二者中，GSVA评分越高都预示着不良预后，但在KRAS-MUT肺癌患者中，GSVA评分对于不良预后的评估更加显著（Fig.S10d）。从Cox比例风险回归模型（纵坐标代表不良预后风险，横坐标代表GSVA评分）中也可以看到，GSVA评分对于KRAS-MUT肺癌患者的不良预后风险评估更具有参考意义，而对于KRAS-WT肺癌患者，GSVA评分的参考意义有限（Fig.S10e）。最后，作者从联合用药的角度对CPD敲除和KRAS（G12C）抑制剂ARS-853进行了评估，表明在某些肺癌细胞系中，二者的联合运用能够发挥更显著的抑制肿瘤细胞增殖的作用（Fig.S10f），而对于IGF1R信号较弱的细胞系不能发挥抑制作用（Fig.S10g,h）。本篇文章用高通量手段，从全基因组范围检测了3D培养体系中驱动肿瘤发生的基因突变。与2D培养体系下的检测结果相比，3D培养体系能够更准确地模拟肿瘤在体内的真实发生状况，让我们在对驱动肿瘤发生的一些致癌突变上有了更新的认识。从高通量数据中，作者还找到了一个全新的未被研究的潜在肺癌治疗靶点羧肽酶D（CPD），并对CPD的功能、机制以及临床应用进行了分析阐述，表明CPD可以作为临床肺癌预后评估指标和治疗靶点的前景。参考文献：Han K, Pierce SE, Li A, et al. CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities. Nature. 2020;580(7801):136-141
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