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再千丝万缕的关系，也都给你捋清楚了。
免疫系统相当于人体中“清道夫”，正常情况下，免疫系统可识别并清除肿瘤微环境中的肿瘤细胞。然而，“狡猾”的肿瘤细胞可在免疫系统的监察下，发展出多种逃脱免疫杀伤的机制，从而在抗肿瘤免疫应答的各阶段得以幸存。
近年来，肿瘤免疫治疗已成为晚期恶性肿瘤治疗的重要手段之一，并在多种肿瘤中取得了不错的效果。RNA失调存在于多种疾病当中，包括肿瘤。但RNA失调与肿瘤免疫治疗之间的关系尚无系统描述。
近期，来自美国宾夕法尼亚大学的Yi Xing教授以通讯作者身份在国际著名杂志Trends in Pharmacology Sciences上发表了题为“RNA Dysregulation: An Expanding Source of Cancer Immunotherapy Targets”的重磅综述，系统阐明了由RNA失调在肿瘤免疫治疗中的作用。
为了帮助大家学习和工作，笔者最近通读了全文，将其翻译成了中文，方便大家学习参考，希望大家都能有所收获！
亮点
1）寻找最佳的肿瘤抗原（tumor antigens，TAs）是开发安全有效的靶向免疫治疗药物的关键。新的TAs资源（超越体细胞突变）需要扩大目前的治疗范围。
2）RNA加工的失调通过改变基因产物的丰度和多样性来改变癌症转录组和蛋白质组。RNA失调引起的抗原是潜在的肿瘤免疫治疗靶点。
3）高通量技术的最新进展和公共存储库中多组分癌症分析数据的快速积累为系统地描述癌症中RNA失调提供了机会。
4）为了全面地发现和预测RNA失调引起的TAs，我们提出了一种整合了最新实验和计算工具以及肿瘤和正常组织的大规模参考数据资源的多组学和大数据策略。
摘要
癌症转录组经常表现出RNA失调。由于由此产生的异常转录物可能被翻译成癌症特异性蛋白，利用RNA失调作为肿瘤抗原（tumor antigens，TAs）的来源，从而开发新的免疫治疗靶点的兴趣与日俱增。高通量技术的最新进展和公共存储库中多组分癌症分析数据的快速积累为系统地描述癌症中的RNA失调和确定免疫治疗的抗原靶点提供了机会。然而，鉴于癌症转录组和蛋白质组的复杂性，存在着重要的理论和技术挑战。在这里，我们强调了由RNA失调引起的TAs的扩展，并介绍了用于确定最佳免疫治疗靶点的多组学和大数据策略。我们讨论了将这些靶点转化为有效治疗的现存障碍以及对未来研究的暗示。
RNA失调作为肿瘤免疫治疗靶点来源
细胞的转录和蛋白质合成受多种RNA水平调控过程的控制。Pre-mRNA可变剪切和RNA编辑，可以从单个基因产生多个蛋白质亚型，极大地扩展了人类细胞的编码能力和蛋白质库。
癌细胞在RNA处理中表现出广泛的异常，包括驱动力的改变，这些改变在功能上有助于癌症的发展和进展。通过普遍的RNA失调，癌细胞可以表达一组不同的转录和蛋白质，其中一些可能代表治疗靶点。
靶向肿瘤免疫治疗在治疗侵袭性恶性肿瘤方面取得了巨大成功；然而，重要挑战和未满足的需求仍然存在。寻找靶向肿瘤抗原（TAs）是开发具有安全有效抗肿瘤免疫的免疫治疗方法的一个关键方面。
目前TA发现的工作主要集中在蛋白质编码区（即新抗原）和一些已知的替代来源，例如谱系特异性抗原和癌/睾丸抗原。这些策略只搜索癌细胞中蛋白质组学的一小部分，对于许多癌症类型无效。
现在有令人信服的证据表明，RNA失调引起的TAs可能代表了一个广泛但大部分未被探索的新免疫治疗靶点。通过本文，我们努力提高对这一新兴TAs的认识，目的是激发概念和技术的进步，将这些新的目标转化为新的癌症免疫疗法。
针对过继细胞疗法的TAs
疫检查点阻断（ICB）和过继细胞治疗（ACT）的肿瘤免疫治疗通过增强和改造患者的抗肿瘤免疫功能，实现了肿瘤治疗的范式转变。免疫疗法已经获得了提高患者的生存率持久的反应以及对侵袭性和以前无法治疗的癌症的其他好处。TAs在诱导强烈的抗肿瘤免疫中起关键作用。
ICB的临床疗效被认为来源于它能够重新激活T细胞对TAs的反应。在ACT中，T细胞通过不同的机制识别TAs，通过靶向细胞表面蛋白的细胞外肽进行嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗或通过MHC分子靶向细胞表面呈现的肽表位进行T细胞受体（TCR）治疗。
肿瘤细胞中的DNA、RNA或蛋白质改变可以产生TAs。TAs的某些特征对于确保免疫治疗的成功至关重要。理想情况下，TAs的表达应仅限于癌细胞或非活细胞系，这一特征与其表达选择性和癌症特异性有关。另一个重要的考虑因素是TAs外来性，即抗原被患者免疫系统识别为“非我”的程度。
癌症基因组测序的进展使TAs发现的临床成功策略聚焦于体细胞突变。具体而言，癌症基因组改变，包括单核苷酸变异（SNV）、插入-缺失变异和基因融合，可以通过对给定患者的肿瘤DNA与正常DNA进行测序和比较来检测。蛋白质序列分析可以识别产生抗原肽的蛋白质编码区的体细胞突变。
虽然这一策略已经确立，但也有重要的局限性。体细胞突变通常只针对一小部分患者，因此需要在个体化的基础上进行治疗研发。
此外，只有一小部分的体细胞突变改变了蛋白质序列并具有很强的免疫原性，因此限制了这种策略在许多具有中等或低突变负荷的癌症类型中的应用。鉴于这些固有的局限性，需要对新型TAs进行系统的探索。
RNA失调衍生的TAs
作为免疫治疗的靶点
RNA转录调控在调节基因表达和产生基本生物功能所需的不同转录物和蛋白质异构体方面起着关键作用。RNA加工受顺式调控元件和反式调控因子的调控，其功能可被癌症中的体细胞突变和致癌信号通路所破坏。RNA相关过程的失调可以重塑癌症转录组和蛋白质组的格局。
因此，这种失调可以通过改变转录物和蛋白质的丰度和多样性来调节细胞表型。其中一些蛋白质可能含有癌症特异性抗原肽。本文综述了RNA失调的主要机制以及RNA失调作为肿瘤免疫治疗靶点来源的研究进展。
1、RNA表达改变
RNA表达的改变是癌症转录组变异的主要来源，有时起着重要的致癌作用。RNA在癌细胞中的过度表达可由转录或转录后过程引起，这些转录或转录后过程可增强基因转录或RNA的稳定性。
如果相应的蛋白产物在一种癌症类型的患者中持续过度表达，或者甚至在多种癌症类型中持续过度表达，并且如果蛋白表达在正常组织中低且稀疏，那么该蛋白可以作为候选TAs。
一些临床靶向TAs遵循这种模式，在肿瘤中持续高表达，在正常细胞中低表达或谱系限制表达。然而，有限的免疫原性和肿瘤外毒性问题仍然存在。
2、可变剪切
Pre-mRNA的可变剪切是人类细胞基因产物多样化的一种普遍机制。正如在癌转录本中广泛存在的，并有助于每一个“癌症的特征”，这是癌细胞与正常细胞相比的重要表型特征。
与之相关的癌症可以通过多种机制，例如产生促进细胞增殖、抑制细胞死亡、避免抗肿瘤免疫或促进侵袭和转移的蛋白质亚型等多种机制，在功能上调节癌症的发展和进展。此外，可变剪切可能预测患者的预后和治疗反应。
另外，剪接的外显子或剪接连接可以转化为富含癌细胞的抗原肽。一些与癌症相关的外显子或剪接连接可能源于体细胞突变，产生了正常细胞中不存在的新剪接位点，使其具有高度的癌症特异性。
此外，可变剪切对最终蛋白产物引入较大的序列变化，可能使可变剪切衍生的TAs比体细胞突变引入的单个氨基酸变化更“外来”和免疫原性。
RNA测序（RNA seq）对许多癌症类型的研究显示，可变剪切的转录体有广泛的变化。
Kahles等人将肿瘤组织与正常组织进行比较，发现肿瘤组织中砷含量升高，包括许多先前未被认为是事件，其中大多数是外显子跳跃和备选3′剪接位点事件。他们以剪接连接肽为候选抗原，利用质谱（MS）蛋白质组学数据验证了部分肽的表达，并基于与MHCⅠ类分子的预期结合预测候选抗原。
然而，候选TAs的免疫原性未经实验测试。最近的一项泛癌研究表明，异常的癌特异性外显子可能通过剪接位点在内含子序列中产生体细胞突变，通过一个叫做外渗的过程来引入。内含子保留的失调，一种特殊类型的可变剪切，在癌症中也很常见，并提供了一种灭活肿瘤抑制因子的机制。
Smart等人通过实验验证MHCⅠ类内含子保留衍生肽的表达，表明它们具有潜在的免疫原性。这些研究为作为一种新的免疫治疗靶点的有希望的来源提供了有力的证据。
由于编码剪接调控因子的基因在癌症中经常发生突变，因此，某些癌症类型和携带特定癌症驱动基因突变的患者的可变剪切衍生TAs的基因库可能特别大。
并不是所有的可变剪切亚型都能产生蛋白质产物。无义介导的mRNA衰变（NMD）途径是转录后调控的一个重要机制，它降解含有提前终止密码子（PTC）的mRNA转录物。肿瘤中新的可变剪切亚型可能含有PTC，通过NMD导致转录物降解。
尽管如此，有证据表明，在NMD之前的第一轮mRNA翻译过程中产生的肽可能仍然通过MHCⅠ类途径呈现。此外，已知NMD机制在癌症中失调，可能允许将含有PTC的转录物翻译成蛋白质产物和Tas。
3、非标准剪接
非标准剪接事件可以产生新的转录物和蛋白质。在没有染色体重排的情况下，嵌合RNA（融合转录物）可以通过远程基因座之间的反式剪接或相邻基因之间的顺式剪接（顺式SAGe）产生。
在胚胎干细胞和其他非癌症组织中发现了由反式剪接和顺式SAGe产生的嵌合RNA。许多嵌合RNA已被确定为癌症的生物标志物或潜在治疗靶点。如果癌症特异性嵌合RNA被翻译成蛋白质，那么从嵌合RNA衍生的癌症特异性肽可能是候选TAs。
尽管存在多种检测嵌合RNA的工具，但从癌症RNA序列数据中检测到的嵌合RNA的真实性仍然令人担忧，因为许多这样的RNA可能代表测序或检测伪影。嵌合RNA衍生TAs的肿瘤特异性和免疫原性必须考虑到嵌合RNA也在正常组织中表达。
环状RNA是一类独特的RNA分子，在mRNA剪接前形成的反向剪接事件形成共价闭环。环状RNA在正常细胞中具有生物学功能，但在癌细胞中可能会失调，从而在肿瘤组织中产生明显的环状RNA表达谱。
虽然环状RNA缺乏5′cap，但它们可以使用cap独立翻译机制。这就提出了一些癌特异性的环状RNA可能被翻译成产生抗原肽的有趣可能性。
目前，对于癌细胞内环状RNA的调节和功能，尚不清楚。然而，研究者已经建立了癌症相关的细胞周期数据库，希望这些环状RNA可以作为生物标志物或治疗靶点。
4、RNA编辑
RNA编辑是人类细胞中普遍存在的转录后调控过程。最丰富的RNA编辑类型是腺苷到肌苷（A-to-I）RNA编辑。A-to-I RNA编辑在正常生物过程中的RNA调节和蛋白质重编码中起着重要作用，其失调是包括癌症在内的许多人类疾病的基础。
最近的大规模癌症转录组研究调查了不同癌症类型的RNA编辑图谱。A-to-I RNA编辑与临床相关特征相关，包括患者生存率、药物敏感性和癌症进展。
RNA编辑有助于癌细胞的蛋白质组多样性。利用MS免疫肽组学数据和T细胞介导的细胞杀伤试验，Zhang等人提供了实验证据，证明RNA编辑衍生肽可由MHC分子呈现并引发免疫反应。
RNA编辑衍生的TAs被肿瘤组织中浸润的T细胞识别。尽管如此，考虑到RNA编辑酶对RNA编辑调控的混乱性，对肿瘤特异性和肿瘤外毒性的仔细评估是有必要的。
5、表达转座因子
转座因子（Transposable elements，TE）约占人类基因组的一半，在人类生物学和疾病中发挥着重要作用。在人类癌症中，由于DNA甲基化的整体缺失导致的TEs失调很常见。
TE启动子的低甲基化允许表观遗传学沉默的TE在癌症中重新表达。在几种癌症类型中，长时间散布的核子元件-1（LINE-1）启动子低甲基化与较差的临床特征（如预后差、耐药性和肿瘤侵袭性）有关。
为了系统地研究TE启动子的激活及其对基因表达的影响，Jang等人最近分析了TCGA中的RNA-seq数据，共收集了15种癌症类型的7769个肿瘤样本。他们表明，表观遗传活化的秘密调控元件内的胚胎干细胞驱动癌基因的激活。TE相关转录物可完全来源于表达的TE作为独立转录单位，或部分来源于TE衍生的替代启动子和作为宿主基因一部分的第一外显子。
来自异常表达的TEs的肽可能是免疫系统和免疫原的外来肽。Laumont等人将RNA序列数据与MS免疫肽数据结合，发现内源性TEs产生的异常表达但非突变转录子可转化为靶向TAs。
同样，Kong等人评估了TE在癌转录本中的表达，并证明了从TE中衍生的肽，如人内源性逆转录病毒（HERV）、直线、短插入核元素（SINE）和SINE VNTR Alu（SVA）元素均出现在MHC I类分子上。
研究表达的TEs的一个困难是准确发现和定量TE衍生转录本，因为它们在人类基因组中的序列重复性对标准short-read RNA测序提出了挑战。未来的研究使用long-read RNA测序可能提供更好的表达TEs及其在癌症中的TA序列的参照。
RNA失调衍生的TAs多组学和大数据策略
由于人类转录组和蛋白质组的复杂性，可靠地发现RNA失调衍生的TAs在技术上是困难的。至少，一个有效的策略必须（i）精确描述肿瘤中转录序列和丰度，（ii）可靠地鉴定翻译蛋白产物，（iii）可靠地确定推定靶点的表达选择性和癌症特异性，以及（iv）系统地评估鉴定癌症特异性肽的可能性可以通过免疫疗法作为靶点。
然而，这也存在一些挑战。对于未注释或来源于复杂RNA处理事件的癌症特异性转录物，识别精确的全长RNA序列及其相应的蛋白质产物并非易事。
此外，很难确定候选TAs的表达选择性和肿瘤特异性，这是靶向免疫治疗有效性和肿瘤外毒性的重要特征。对于TCR靶点，表位预测仍然是一个活跃的研究课题，现有的工具具有有限的准确性和可重复性。对于CAR-T靶点，蛋白质的细胞表面定位和拓扑结构需要预测和确认。
鉴于这些挑战，需要一个综合的多组学和大数据策略，结合最先进的实验和计算工具，以及肿瘤和正常组织的大规模参考数据资源，以全面发现和优先排序RNA失调衍生的TAs。
1、精确的RNA序列表征和定量
短读RNA测序是最广泛用于分析人类转录组的工具，在癌症和正常组织的大规模分子分析中有着广泛的应用。除了量化整体基因表达水平外，短读RNA测序还检测许多类型的转录物改变，如可变剪切和RNA编辑。因此，短读RNA测序是目前研究癌症转录组中RNA加工失调的主要方法。
已经开发了先进的计算和统计算法来精确分析短读RNA测序数据。其中包括对齐RNA测序读取和量化基因表达水平的通用算法以及表征特定类型转录物改变的专用工具。通过将RNA测序数据分析与下游的蛋白质推断和抗原预测分析工具相结合，研究人员可以检测出来自多种RNA失调的候选TAs。
尽管短读RNA测序在癌症研究中有着广泛的应用和成功，但这种方法在推断复杂的RNA处理事件及其产生的转录物和蛋白质产物方面还存在不足。蛋白质产物的可靠推断需要全长转录物的知识。
由于短读RNA测序只检测全长转录物的片段，因此很难推断与已识别的RNA处理事件相对应的蛋白质产物，特别是对于新的、未注释的事件。某些类型的癌症相关转录物，如嵌合RNA和表达的TEs，通过短读序列来表征是特别具有挑战性的。
近年来，人们对长读RNA测序技术越来越感兴趣，这种技术可以克服短读RNA测序的许多固有限制。短读RNA序列通常产生高达600个碱基的读取。相比之下，在第三代测序平台上的长读RNA序列可以产生超过10 kb的读取量。因此，长读RNA测序可能是解析全长转录结构和高度重复转录序列的理想工具。
长读RNA序列也有助于开放阅读框（ORF）的精确推断和潜在NMD靶点的可靠识别。尽管长读RN测序具有潜力，但由于其高错误率、低吞吐量和相关的计算挑战，它仍然是人类转录组分析中一种未被充分利用的技术。
尽管如此，随着技术的不断进步，我们期望长读RNA测序将成为一种强大的、广泛应用于癌症转录组分析和TA发现的工具。例如，最近的一项研究使用长读RNA序列来识别非小细胞肺癌中的异常AS亚型和潜在TAs。
2、mRNA翻译与蛋白表达的综合检测
并不是所有的转录物都被翻译成稳定的蛋白质产物。对于TA的发现，确认通过转录组分析发现的肿瘤特异性转录物的蛋白表达是重要的。一些实验和计算方法为mRNA翻译和蛋白质表达提供了证据。
Ribo测序是一种基于RNA测序的核糖体分析策略，在这种策略中，核糖体保护的mRNA片段被捕获并测序。Ribo测序已被广泛用于分析核糖体与不同RNA物种的关联，并量化mRNA翻译效率，为翻译控制在调节蛋白质表达中的作用提供了见解。Ribo测序是识别ORF的一个特别强大的工具，因为翻译的ORF中的Ribo测序信号显示出独特的特征。
因此，Ribo测序可以极大地限制搜索空间，降低电子搜索候选TAs时的假阳性率。事实上，最近的Ribo测序研究从数千个新的未注释ORF中鉴定出MHCⅠ类结合肽。
基于质谱的蛋白质组学在全球范围内表征蛋白质的表达和修饰。不同的样品制备和标记方法结合不同的质谱仪器已被开发用于分析蛋白质表达、修饰、蛋白质-蛋白质相互作用和其他蛋白质组学特征。
基于质谱的蛋白质组学可以应用于全细胞蛋白质组或特定的亚组，如MHC结合肽（免疫肽组）和细胞表面蛋白（细胞表面组）。大规模的研究已经在癌症和正常组织中产生了基于质谱的蛋白质组学数据。这些数据为确认RNA测序数据中推测的TAs的蛋白表达提供了重要的资料。
蛋白质基因组学是一种越来越流行的肽鉴定方法，其中基于质谱的蛋白质组学数据与相应的基因组和/或转录组学数据相补充。在基于质谱的蛋白质组学中，肽的鉴定需要根据已知蛋白质的文库（数据库）搜索质谱谱。
因此，与能够发现新事件的RNA测序不同，基于质谱的蛋白质组学依赖于质谱搜索库的完整性和准确性，因为不包括在搜索库中的蛋白质无法被检测到。基于转录组学数据（如RNA测序和Ribo测序数据）生成的定制样本特异性搜索库可显著提高检测率并减少假阳性。
事实上，作为一种数据驱动的方法，蛋白质基因组学可以在蛋白质水平上检测未注释的事件（例如新的可变剪切或RNA编辑事件），而这在标准质谱搜索库中是不存在的。
此外，转录组学数据可用于从质谱搜索库中去除对应于非表达（RNA测序）或非翻译（Ribo测序）mRNAs的蛋白质产物，从而改进肽鉴定。许多研究已经应用蛋白质基因组学来检测癌症转录组和蛋白质组，从而鉴定出新的癌症特异性肽和表位。
蛋白质基因组学对于识别“非典型”翻译事件的产物尤其有用，例如从环状RNA翻译的蛋白质或从含有PTC的逃避NMD的转录本翻译的蛋白质。此外，这种方法可以应用于现有的基于质谱的蛋白质组学数据集的回顾性研究，以确认癌细胞中新类型RNA失调所产生的表达蛋白。
3、免疫治疗抗原表达的特征
并非所有表达蛋白的肽都能通过TCR或CARs获得。要识别，肽必须由MHC分子呈现，或分别位于细胞表面，以便TCR或CARs分别识别。为了确认抗原的表达，可以用专门的基于MS的蛋白质组学方法来描述免疫肽体或细胞表面。
免疫肽学检查结合到抗原提呈分子的肽，为MHC分子在细胞表面呈现肽提供实验证据。这种方法在免疫肿瘤学中已得到广泛应用，作为发现和验证TAs的工具。细胞表面组学用于描述蛋白质在细胞表面的表达。利用这项技术，研究人员发现了细胞表面蛋白作为晚期前列腺癌CAR-T治疗的TAs。
为了便于肽的鉴定，免疫肽学和细胞表面组学数据可以与蛋白质基因组工作流中的RNA序列数据配对。作为基于MS的方法，免疫肽学和细胞表面组学都受到适度敏感性的限制。然而，它们在抗原发现和靶向免疫治疗的验证中仍有着广阔的应用前景。
4、基于大数据的RNA失调衍生的TAs的发现和排序
大量的数据集，包括DNA测序、RNA序列、肿瘤和正常组织的蛋白质组学数据以及临床注释，已经积累在公开的资料库中。这些数据集提供了丰富的资源来发现和优先排序来自RNA失调的TAs。
大规模多组学数据的有效整合对于解决癌症转录组学和免疫治疗中的复杂问题至关重要。经过大数据培训，先进的统计和机器学习模型可以增强我们解释数据和做出准确预测的能力。
例如，基于RNA测序的可变剪切分析的敏感性可以通过使用在覆盖许多细胞状态和扰动条件的大规模RNA测序数据上训练的深度学习模型来增强。类似地，结合RNA测序数据训练免疫肽组学模型，可以提高MHCⅠ类和Ⅱ类分子与抗原结合的预测精度。
正如参考基因组有助于发现体细胞突变，肿瘤和正常组织的大规模参考RNA测序和蛋白质组学数据集有助于发现和优先排序RNA失调衍生的TAs。每一个肿瘤样本都可能含有数千个具有蛋白质编码潜能的异常表达的RNA。
因此，候选人助教必须有效地优先考虑。通过查询肿瘤和正常组织的大规模参考数据集，可以根据关键特征（包括其表达选择性和肿瘤特异性）来评估和排序TAs。
同样地，通过检查来自同一癌症类型的数据，可以发现患者共同拥有的“公共”TA。这些特点将指导选择低肿瘤毒性和广泛的临床应用于治疗开发的候选TA。
结束语和未来展望
RNA失调为靶向免疫治疗提供了潜在的广泛的TAs来源。已知可变剪切、嵌合转录物、环状RNA、RNA编辑和表达的TEs的特定模式在癌症转录组中被改变，从而产生大量癌症特异性蛋白。
然而，在这些候选助教被可靠地识别并转化为有效的治疗方法之前，还需要解决大量的概念障碍和技术挑战。虽然来自体细胞突变的新抗原已经被广泛地描述，但是RNA失调作为TAs的来源代表了一个仍在积极探索中的新兴概念。因此，现有的研究通常使用特别的标准来定义和报告这类助教。
目前还缺乏用于识别RNA失调衍生TA的集成计算平台，也没有成熟的标准或工具来识别这类TA。在这篇综述中，我们概述了一个概念框架以及识别RNA失调衍生TA的一般原则。我们预计这些讨论将有助于推动新的实验策略和计算工具的发展，这是在研究界的高需求。
RNA失调衍生TA的一些机制和免疫学特征仍然不清楚。最重要的是，候选TAs的表达选择性和肿瘤特异性必须被系统地检测，以确保高免疫原性和低肿瘤毒性。目前的研究主要是以一种特殊的方式选择数据集来定义常见RNA处理事件的正常转录组谱（例如可变剪切]）。
未来的工作应该为不同类型的RNA失调和患者群体建立标准化的转录组参考。例如，基因型组织表达（GTEx）是正常转录组图谱的常用参考数据库，但GTEx RNA序列数据仅来源于成人组织。正常儿童组织的转录组参考将有助于在儿童癌症中发现TA。新的单细胞RNA序列数据集可以通过添加细胞类型特异性和空间信息进一步提高转录组参考的分辨率。
重要的是，由于这些转录组参考可能来自不同的数据源，因此需要标准化和可重复的计算工作流程和最佳实践来控制生物和技术混杂因素，包括批处理效应，并将这些异质数据聚合到一个统一的资源中。
一个关键的问题是开发针对RNA失调衍生TAs的免疫疗法是其在治疗反应中表达的稳定性。据报道，可变剪切是CD19靶向CAR-T治疗引起抗原逃逸和治疗抵抗的机制。Sotillo等人在一项对CD19 CAR-T治疗后复发的B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者的研究中报告，CD19 mRNA可以选择性剪接，导致CAR-T识别所需的表位丢失以及CD19蛋白的细胞表面表达丢失。
从这一发现推断，可以想象，可变剪切或其他类型RNA失调引起的TA可能在治疗过程中作为耐药机制在癌症中丢失。要开始解决这个问题，我们必须了解给定的TA是如何生成的。肿瘤特异性异常转录物可能是由于体细胞突变破坏顺式调控元件或致癌途径以及改变反式调控因子表达或活性的细胞信号引起的。
从这些不同机制（顺式和反式）衍生出的TA可能对治疗有不同的反应轨迹。靶向“稳定”TA的一个可能策略是识别和选择在功能上驱动癌症发展的异常转录物。或者，也可以靶向由致癌因子直接调控的转录物。
例如，Phillips等人最近发现，在多种癌症类型中，大约有500个事件是由MYC癌基因持续调控的。由于MYC在许多侵袭性癌症中起着关键作用，这些MYC调控的As事件可能是免疫治疗的有吸引力的靶点。
与治疗耐药性相关的一个问题是抗原克隆性。在RNA失调衍生TA的背景下，了解肿瘤细胞表达特定TA的部分是很重要的。RNA加工事件的异质性在单细胞水平上尚未得到很好的表征。异构体解析的单细胞转录组学技术（如单细胞长阅读RNA序列）的未来发展和应用可以在异构体解析中破译癌症转录组的克隆结构，并有助于TA的发现和排序。
TA发现的重要技术和计算问题仍有待解决。抗原预测算法需要进一步升级。基于最先进的表位检测方法（如免疫肽组学）的体内数据训练的算法在抗原与MHC分子结合方面优于旧一代的预测工具；
然而，仍有很大的改进空间。同样，转录物和蛋白质的鉴定仍然是基因组学和计算生物学的一个挑战。长读RNA测序结合多组学数据整合（如蛋白质基因组学）可使癌症转录组和蛋白质组的特征更全面和准确，从而促进TA的发现。
本文主要研究了发现和优先考虑候选RNA失调衍生的TAs的策略。然而，必须在临床前阶段对此类候选助教进行严格测试。为了检测TCR靶点的免疫原性和有效性，需要MHC多聚体检测和其它T细胞功能检测。
对于CAR来说，确定候选TAs在细胞表面的稳定表达和拓扑结构是非常重要的。需要在模型系统中评估TCR或CAR-T疗法的疗效和潜在毒性。如果这些研究成功，随后的临床发展可以看到新的靶向性肿瘤免疫治疗方法到达临床。
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