乳腺癌血管生成拟态分子机制研究进展

陈宇潇，倪成铭，陈婷

张金梦，孙瑞凤，杨薇

张治宣，宫海凤，赵涵

蔡维维，邱丽颖，冯磊

江南大学无锡医学院

　　血管生成拟态（VM）是指不依赖内皮细胞的，由侵袭性肿瘤细胞构成的功能性血管样结构。乳腺癌中，VM参与了肿瘤的血液供应、转移和耐药等过程，与患者不良预后有关。笔者主要论述了血管信号通路、上皮-间质转化（EMT）及HER2、钠氢交换子调节因子1（NHERF1）、密封蛋白（claudin）等关键蛋白在乳腺癌VM形成过程中的作用，旨在为临床诊疗策略的优化及靶向药物的研发提供理论依据和方向。

通信作者：冯磊（[e-mail]）

原文参见：中华乳腺病杂志. 2017;11(2):97-101.

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　　肿瘤血管的结构功能与肿瘤的生长、转移密切相关。近年来的研究发现，构成肿瘤血管结构的细胞存在异质性，其不仅可以是宿主来源的内皮细胞，还可以是由肿瘤细胞转分化形成的内皮细胞，或由肿瘤细胞直接构成【1-2】。而这种不依赖内皮细胞的，由侵袭性肿瘤细胞构成的功能性管腔样结构，即为血管生成拟态（VM）。VM由Maniotis等【1】在1999年研究人眼葡萄膜恶性黑色素瘤时发现并提出。

　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在中国其发病率呈持续上升趋势。研究发现乳腺癌中VM能够促进肿瘤生长、转移和耐药，与患者的不良预后有关【3-4】。近年来，国内外学者主要从肿瘤微环境、肿瘤干细胞（CSC）及上皮-间质转化（EMT）、细胞外基质重塑等方面开展研究，部分阐明了乳腺癌VM形成的分子机制，为药物研发提供了潜在靶点，为临床策略的优化提供了理论依据。

　　1　VM在乳腺癌中的临床研究

　　VM本身可以改善乳腺癌的微循环，促进肿瘤细胞转移，同时形成VM的肿瘤细胞因具有更高干细胞特性而表现出更恶性的生物学行为。Wagenblast等【5】揭示了VM促进乳腺癌转移的一种具体机制，其证明具有抗凝活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpine2和分泌性白细胞蛋白酶抑制因子（Slpi）2种蛋白是乳腺癌中VM生成的首要条件，并且这2种蛋白还可以增加血管渗透性，通过促进肿瘤细胞进入血管的过程，从而促进肿瘤细胞转移，为抗肿瘤治疗提供了新靶点。进一步的临床研究表明，乳腺癌中VM高表达与患者的淋巴结转移、高组织学分级、诺丁汉预后指数呈正相关，VM阳性患者的OS和5年生存率均显著低于VM阴性者【4】。

　　与此同时，VM还被认为与乳腺癌内皮性血管靶向治疗的失败有关。临床研究表明，尽管运用贝伐珠单克隆抗体联合单药化疗可以延长乳腺癌患者的无进展生存期，但对OS却无明显影响【6】。类似的，针对舒尼替尼的3期临床研究结果提示，联合或单独应用舒尼替尼并不能有效改善乳腺癌患者的临床结局【7-8】。有学者认为这与血管靶向治疗诱导了肿瘤侵袭性增加，以及肿瘤通过其他信号通路促进肿瘤血管生成等有关【9】。而最近的研究发现，血管阻断剂考布他汀A4磷酸酯（CA4P）、抗血管生成剂舒尼替尼等内皮性血管靶向药物可造成肿瘤内局部的缺氧微环境，继而通过缺氧诱导因子（HIF）/缺氧反应元件（HRE）激活VM相关信号通路，促进了VM的形成，从而导致肿瘤的快速再生长和侵袭性增加【3,10】。

　　因此，就肿瘤血管靶向治疗而言，传统的血管靶向药物可诱导乳腺癌发生VM等适应性改变而产生耐药，而抗内皮性血管和VM生成可能是一种更为理想的治疗策略。然而，需要指出的是目前针对乳腺癌VM的药物研究大多仍处于探索阶段，其疗效尚缺乏临床研究证实。

　　2　VM形成的信号通路

　　2.1　血管信号通路

　　血管内皮细胞（VE）钙黏着蛋白和促红细胞生成素产生肝细胞受体A2（EphA2）是较早被证实与VM有关的2种蛋白。VE-钙黏着蛋白可以调节EphA2的磷酸化水平及部位，从而激活黏着斑激酶（FAK）、细胞外信号调节激酶（ERK）1/2，继而激活枢纽型PI3K；活化的EphA2也可不依赖FAK、ERK1/2而直接激活PI3K信号通路【11-13】。而PI3K可以上调基质金属蛋白酶（MMP）14的表达，进而激活MMP2，最终导致层黏连蛋白5酌2被切割为酌2蒺和酌2x片段，促进细胞外基质重塑和VM的形成【12,14-15】。VE-钙黏着蛋白及EphA2是多条信号通路的下游靶点，因而VE-钙黏着蛋白/PI3K/MMP作为共同终末通路，该通路的下调表达往往是分子水平VM形成受到抑制的标志。Sun【16】、Zeng【17】、Ju【18】及Shi等【19】学者构建了不同修饰物修饰的靶向性载药脂质体，其内分别包裹了奎纳克林、达沙替尼、塞来昔布和舒尼替尼等药物，而这些药物可以下调肿瘤细胞中VE-钙黏着蛋白、FAK、PI3K、MMP2和MMP9等蛋白的表达，抑制乳腺癌VM的形成。然而，乳腺癌中各因子影响VE-钙黏着蛋白、EphA2表达的具体机制尚未完全清楚。在肝细胞肝癌（HCC）研究中发现，EMT因子Twist1可以直接结合于VE-钙黏着蛋白基因的启动子区并促进其转录，从而上调VE-钙黏着蛋白的表达，最终促进VM的形成【20】。Twist也可以通过下调微小RNA（miR）-27a-3p而间接地上调VE-钙黏着蛋白表达，实验证明miR-27a-3p可以结合于VE-钙黏着蛋白3'-UTR从而下调其表达【21】。乳腺癌中Twist是否通过同样的机制促进VE-钙黏着蛋白的表达尚需进一步的研究证实。

　　环氧化酶（COX）2可以催化花生四烯酸转化为前列腺素（PG）E2，并通过激活前列腺素类受体（EP）1-4，最终提高肿瘤细胞的增殖能力、侵袭能力和血管生成。在乳腺癌中，COX2的高表达与肿瘤的淋巴结转移、病理分级、HER2表达水平等均呈正相关，提示患者预后不良【22】。近期研究提示，三阴性乳腺癌（TNBC）是COX2高表达的独立预测因素【23】。此外，COX2被证实与乳腺癌中VM形成有关，运用COX2选择性抑制剂塞来昔布或小干扰RNA（siRNA）可以抑制肿瘤细胞VM形成，而加入外源性PGE2后，可以解除这种抑制效应【24】。针对EP的研究发现，在炎性乳腺癌中，利用EP3激动剂硫前列酮可以抑制肿瘤VM的形成，而EP4拮抗剂GW627368X则对VM形成无明显影响；而TNBC中VM的形成则不受硫前列酮或GW627368X的影响，提示EP3介导了COX2促进炎性乳腺癌形成VM的过程【25】。此外，Ravi等【26】发现藻青蛋白可以抑制TNBC中VM形成，其机制可能与藻青蛋白抑制COX2表达有关。上述研究为乳腺癌中以COX2为靶点的VM靶向治疗提供了依据和新的思路。

　　血管内皮生长因子（VEGF）-A是血管生成重要的调节因子之一，在多种肿瘤中过表达，与肿瘤的增殖、侵袭和转移有关。黑色素瘤中VEGF-A通过激活VEGF受体（VEGFR）-1而非VEGFR-2，继而活化蛋白激酶C（PKC）α，从而促进肿瘤细胞VM形成【27】。黑色素瘤中肿瘤细胞还可以在内皮素1的促进下，通过VEGF-C/VEGFR-3形成VM【28】。而与之不同的是，在乳腺癌中，高表达的VEGF通过激活VEGFR-2、VEGFR-3，上调MMP9的表达，从而促进VM形成【29】。此外，成纤维生长因子受体（FGFR）、血小板源生长因子受体（PDGFR）是与VEGFR具有广泛序列同源性的受体酪氨酸激酶，其配体碱性成纤维生长因子（bFGF）、VEGF、血小板源生长因子（PDGF）之间具有协同作用，共同促进肿瘤的发生。乳腺癌的研究发现，PDGFR-β能够促进肿瘤的血管形成、侵袭、转移【30】。近期，Plantamura等【31】证明了PDGFR-β和FGFR-2介导了TNBC中的VM形成。其运用选择性FGFR抑制剂PD173074联合PDGFR抑制剂伊马替尼，或运用siRNA沉默两者基因，均可抑制VM形成，而沉默VEGFR-1和VEGF基因则效果不显著。值得注意的是，该研究发现利用多靶点酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼可以明显抑制乳腺癌中VM形成，这与Hess等【13】的报道相一致。而Zhang等【3】则指出舒尼替尼可以造成肿瘤缺氧继而诱导VM的形成。舒尼替尼在VM中的作用存在矛盾性的原因尚不清楚，可能是由于VM信号通路的复杂性，因而针对VM信号通路的某一上游蛋白进行阻断时，其可以通过其他途径进行代偿，最终降低了其抑制VM的疗效。

　　2.2　EMT相关信号通路

　　EMT指肿瘤细胞从上皮表型向间质表型转变时，对应标志物表达的改变以及肿瘤细胞获得迁徙性或侵袭性增强的功能性改变。在乳腺癌及其他肿瘤中，这个过程被认为与肿瘤细胞获得干细胞特性、自我更新能力、对传统治疗产生抵抗等均相关。针对VM的研究证明，EMT过程是VM形成的重要基础，肿瘤细胞可以通过EMT获得间质细胞表型，从而模仿内皮细胞，模拟胚胎时期血管形成过程，构成功能性管道【32】。

　　Twist是一种保守的螺旋-环-螺旋转录因子，是调控肿瘤细胞EMT过程及促进肿瘤侵袭转移的关键因子。研究证明乳腺上皮细胞中Twist1、Twist2蛋白高表达，可以促进肿瘤经历EMT而获得干细胞表型【33】。与VM直接相关的是，在HCC中，Twist1上调可以通过诱导EMT过程，继而促进VM的形成【21】。而抗凋亡蛋白Bcl-2可以通过与Twist1形成复合体，帮助Twist1进入细胞核并提高其转录活性，协同促进VM形成【34】。在TNBC中，Zhang等【3】发现运用siRNA抑制Twist1表达后，MDA-MB-231细胞株中的CD133表达下降，VM的形成受到抑制；而MCF-7细胞株在转染Twist1后获得了形成VM的能力，并且其构成VM的肿瘤细胞是CD133阳性的，提示Twist1表达可以导致CD133阳性细胞亚群增加，继而促进VM形成。此外，利用葡萄籽花青素则可以通过降低TNBC细胞中Twist1表达，逆转EMT过程从而抑制其VM形成【35】。

　　Wnt/β-联蛋白（catenin）信号通路与细胞增殖、胚性干细胞的保持与分化等有关。该信号通路的激活已被证明与结肠癌肿瘤细胞EMT及VM形成相关，利用Wnt/β-联蛋白信号通路抑制蛋白Pickkopf-1可以下调肿瘤细胞的干细胞特性和CD133、VE-钙黏着蛋白等表达【36】。在TNBC中，实验运用Wnt信号调控分子Wnt-C59、β-联蛋白抑制剂硫化舒林酸及β-联蛋白-siRNA、端锚聚合酶抑制剂XAV939等在不同节点阻断Wnt/β-联蛋白信号通路，均观察到VM的形成受到抑制，从而证明Wnt/β-联蛋白对TNBC中VM形成起到调控作用【36】。

　　其他与EMT过程相关的重要的分子还包括CD133、CD44、泛素特异性蛋白酶（USP44）、上皮生长因子（EGF）等，针对这些分子的研究进一步肯定了CSC在乳腺癌VM形成中所扮演的重要角色。CD133是位于微绒毛等膜突起处或一些上皮细胞的顶面的五次跨膜糖蛋白，亦被认为是乳腺癌、胶质瘤、结直肠癌等多种肿瘤CSC的通用标志物【37】。有研究通过克隆形成实验发现，TNBC中肿瘤细胞CD133表达阳性与其VM相关，提示具有CD133阳性表型和CSC特征的TNBC亚细胞群具有形成VM的能力【38】；CD44是细胞外基质成分透明质酸的受体，是乳腺癌CSC标志物之一，与细胞的增殖、迁移等有关。实验发现在尤文（Ewing）肉瘤中敲除CD44基因可以抑制肿瘤形成VM结构，提示CD44在VM的形成中起到了重要作用【39】；USP44是干细胞相关因子OCT-4潜在的下游靶点，研究证明沉默USP44可以导致乳腺癌CSC中纺锤体的多极化及VM形成的减少【40】；EGF被认为介导了乳腺CSC形成VM的过程，而热休克蛋白（HSP）27则被认为是这条信号通路中的下游分子【41】。该研究发现应用吉非替尼抑制EGFR磷酸化或应用短发夹RNA（shRNA）敲除EGFR基因，以及应用槲皮素抑制HSP27或应用shRNA敲除HSP基因，均可以抑制乳腺癌CSC在体外形成VM，而强制表达HSP27可以消除吉非替尼对VM形成的抑制作用【41】。

　　综上所述，EMT是乳腺癌VM形成过程中的重要环节，而VM作为干细胞表型的其中一种表现，针对CSC或EMT过程的VM靶向治疗，可能比单纯的VM靶向治疗意义更大。然而，有研究发现索拉菲尼可以抑制HCC的EMT过程，但同时长时间的索拉菲尼能诱导HCC中E-钙黏着蛋白减少，波形蛋白显著增加，呈现EMT特征，从而发生耐药【42-43】。结合前述的舒尼替尼相关研究【3,19,31】，基于VM形成机制的复杂性，针对其上游靶点进行阻断的治疗是否有效，仍需要进一步的研究来证明。

　　2.3　与VM形成相关的其他关键蛋白

　　HER2是一种具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，属于EGFR家族。其可以与EGFR家族的其他成员EGFR、HER-3或HER-4形成同源二聚体而产生活化信号。HER2是判断乳腺癌预后的独立指标，其基因的高表达往往提示乳腺癌恶性程度高，易复发转移。最近的研究发现，乳腺癌患者中肿瘤内VM数量与HER2的表达水平有关，外源性HER2可以通过上调VE-钙黏着蛋白增加MCF-7细胞株在体外形成管腔样结构【44】。

　　钠氢交换子调节因子1（Na+/H+NHERF1）作为一种支架蛋白，能通过其氨基端的PDZ-1、PDZ-2结构域以及羧基端的EB结构域，与多种蛋白质相互作用并调节其功能，从而参与肿瘤增殖、凋亡、转移等过程。Cardone等【45】分别用空载质粒、野生型NHERF1、PDZ-1或PDZ-2结构域突变的NHERF1转染MDA-MB-231细胞株，发现PDZ-2突变克隆细胞能够形成VM，而野生型或PDZ-1突变克隆细胞形成VM的能力受损，进而提出PDZ-1和PDZ-2结构域对肿瘤VM及其他表型的调控作用并不一致，两者活性相当时对VM形成表现出抑制作用，而当在某种微环境因素作用下PDZ-2活性受到抑制时，肿瘤形成VM的能力增强，反之亦然。

　　密封蛋白（claudin）是紧密连接中最重要的组成部分，而紧密连接对于封闭内皮细胞与上皮细胞间的间隙，维持细胞极性和通透性等有重要作用。研究证明，密封蛋白-1和密封蛋白-7在侵袭性乳腺癌中表达下降，这被认为为肿瘤的侵袭转移创造了条件【46-47】。近期的研究发现，密封蛋白阴性的乳腺癌细胞亚群表达更多内皮性基因，更易于形成VM，并且其血管通透性更高【48】。而另一方面，Cui等【49】提出密封蛋白-4可能通过促进肿瘤细胞间的连接而参与乳腺癌VM的形成。密封蛋白-4单克隆抗体或shRNA可以抑制乳腺癌细胞形成VM，而MCF-7细胞株中密封蛋白-4的高表达则可以诱导VM的形成【49】。上述研究提示，深入了解不同的密封蛋白家族成员在乳腺癌发生及VM形成过程中所扮演的角色是有必要的，将有助于相关药物的研发。

　　3　结语

　　乳腺癌VM参与肿瘤生长转移耐药等过程，与患者不良预后显著相关【4】，故针对其开展诊疗具有一定的临床意义。乳腺癌细胞可以在缺氧等环境下通过Twist、Wnt等信号通路发生EMT。EMT作为VM形成的重要基础，使乳腺癌细胞获得了更高的干细胞特性，表达VE-钙黏着蛋白等间质细胞表型，从而完成关键的细胞外间质重塑过程，形成VM。而HER2、NHERF1、密封蛋白、Serpine2和Slpi等蛋白也不同程度地参与其中（图1）。针对上述过程的深入研究将有助于乳腺癌VM诊疗策略的优化和靶向药物的研发。

图1、乳腺癌血管生成拟态形成的分子机制示意图

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