关于寄生虫的科学鉴定（2）

写

在

前

面

要健康用鱼康

上次写到了提取DNA，今天接着写后续步骤。

当把DNA提取之后即可以作为模板，接下来就是跑PCR，也就是聚合酶链式反应。

在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以加进去的引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA过程。

PCR技术可运用到基因分离克隆和表达调控、多态性研究、序列分析中。

PCR的反应过程具体如下。

01

变性

先是变性，通过加热到94摄氏度，持续30秒，使DNA双链间的氢链断裂，分开形成单链。

02

退火

然后就是退火，即温度降低，在温度55摄氏度的情况下，引物与模板DNA中的互补区域结合，形成杂交分子。

03

延伸

这个杂交分子在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+存在的情况下，DNA聚合酶催化引物按5’端向3’端方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。

在延伸反应中要求温度在70-72摄氏度，反应时间为30-60秒。这里的加温断裂，然后降温结合，然后又升温延伸为一个循环，经过n次循环，目的DNA就是以2n的形式增加。

PCR反应体系

01

buffer是由纯水和氯钾、Tris组成。Tris用于调节反应体系的PH值，使Taq酶在偏碱性环境中发挥活性；氯化钾可以降低退火温度，但浓度不能超过50mmol/升。

镁浓度为1.5-2mol/升，其对应核苷酸为200微升，核苷酸与镁离子有一个对应浓度关系，核苷酸与Taq酶竞争镁离子，当核苷酸浓度达到1mmol/升，就会抑制Taq酶活性，而镁离子能影响反应的特异性和产率。

02

2个primer各0.2微升，4种核苷酸（A、T、C、G）。

牛血清白蛋白（BSA）100微升，用于提高蛋白质的浓度，在反应中对酶起保护作用，防止酶的分解和非特意性吸附，减轻有些酶的变性，减轻加热、化学因素和表面张力中酶的变性，有的人也会对这个白蛋白过敏。

03

每个反应体系Taq酶1-2.5个单位，这个酶分成两种，一种是R型，一种是L型。能耐受94-95摄氏度的温度，参与DNA聚合酶的反应中，L型的保真性更好，耐肥温度也更高。

模板DNA，大约有10的2至5次方个分子。最后加上又双蒸水，补至到所需体积。