关于寄生虫的科学鉴定(2) 上次写到了提取DNA,今天接着写后续步骤。 当把DNA提取之后即可以作为模板,接下来就是跑PCR,也就是聚合酶链式反应。 在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以加进去的引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA过程。 PCR技术可运用到基因分离克隆和表达调控、多态性研究、序列分析中。
PCR的反应过程具体如下。
先是变性,通过加热到94摄氏度,持续30秒,使DNA双链间的氢链断裂,分开形成单链。
然后就是退火,即温度降低,在温度55摄氏度的情况下,引物与模板DNA中的互补区域结合,形成杂交分子。
这个杂交分子在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+存在的情况下,DNA聚合酶催化引物按5’端向3’端方向延伸,合成出与模板DNA链互补的DNA子链。
在延伸反应中要求温度在70-72摄氏度,反应时间为30-60秒。这里的加温断裂,然后降温结合,然后又升温延伸为一个循环,经过n次循环,目的DNA就是以2n的形式增加。
buffer是由纯水和氯钾、Tris组成。Tris用于调节反应体系的PH值,使Taq酶在偏碱性环境中发挥活性;氯化钾可以降低退火温度,但浓度不能超过50mmol/升。
镁浓度为1.5-2mol/升,其对应核苷酸为200微升,核苷酸与镁离子有一个对应浓度关系,核苷酸与Taq酶竞争镁离子,当核苷酸浓度达到1mmol/升,就会抑制Taq酶活性,而镁离子能影响反应的特异性和产率。
2个primer各0.2微升,4种核苷酸(A、T、C、G)。
牛血清白蛋白(BSA)100微升,用于提高蛋白质的浓度,在反应中对酶起保护作用,防止酶的分解和非特意性吸附,减轻有些酶的变性,减轻加热、化学因素和表面张力中酶的变性,有的人也会对这个白蛋白过敏。
每个反应体系Taq酶1-2.5个单位,这个酶分成两种,一种是R型,一种是L型。能耐受94-95摄氏度的温度,参与DNA聚合酶的反应中,L型的保真性更好,耐肥温度也更高。
模板DNA,大约有10的2至5次方个分子。最后加上又双蒸水,补至到所需体积。
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