Prostaglandin E2 isessential for efficacious skeletal muscle stem-cell function, augmenting regenerationand strength
【文献来源】Atv H, Palla A R, Blake M R, et al. Prostaglandin E2 is essential for efficacious skeletal muscle stem-cell function, augmenting regeneration and strength. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017, 114(26):201705420.
“肌肉损伤本是多种细胞参与的炎性过程，而骨骼肌细胞是一类静止的肌肉特异性干细胞（MuSCs）参与组织再生。本次研究作者发现作为炎性因子的前列腺素E2（PGE2）通过与其受体EP4结合参与肌肉干细胞的延伸….”
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肌肉损伤时PGE2的剧增加速MuSCs增殖
由于细胞损伤和再生过程是一个复杂的炎症反应过程，因此作者推测可能存在着某个炎性因子在肌肉再生中扮演重要作用。首先作者检测了从未受伤的肌肉组织中分离MuSCs（Fresh MuSCs），分离培养2d的（Cultured MuSCs）以及原代肌成纤维细胞（Myoblasts GM）和分化的肌纤维细胞（Myoblasts DM）中PGE2的受体Ptger4 (EP4)表达水平（图1A，肌肉干细胞MuSCs可发育分化为成肌细胞(myoblasts)，后者可互相融合成为多核的肌纤维，形成骨骼肌最基本的结构。这个结果告诉了我们细胞分化程度越高对PGE2受体表达水平越低，也就是说对PGE2敏感性越差，这就奠定了PGE2可能在肌肉是损伤时候其目的作用细胞主要是MuSCs，因此本文也就围绕MuSCs展开研究，随后作者通过在虎蛇毒素（notexin）或低温损伤肌肉后3d检测到PGE2及其合成酶Ptges和 Ptges2的高表达（1B,C,D）。由于PGE2产生可能不仅仅只在MuSCs，作者检测还有肌成纤维细胞也表达,使用非甾体抗炎药NSAIDS（背景知识：（COX-2为同工酶，是诱生型酶。COX-2在正常组织细胞内的活性极低，当细胞受到炎症等刺激时，其在炎症细胞中的表达水平可升高至正常水平的10-80倍，引起炎症部位PEG2、PGI2和PGE1含量的增加，导致炎症反应和组织损伤。非甾体抗炎药NSAIDS是通过抑制COX，阻断花生四烯酸转化为PGs，从而发挥其抗炎、止痛和解热作用）吲哚美辛抑制PGE2表达（1E，因为虽然在肌肉损伤时候可能成纤维细胞也参与但是基于前面的结果，作者排除掉了成纤维而选择MuSCs来研究，此处作为一个补充说明）。同时作者还发现PGE2表达峰值在短时间内是和肌肉损伤后MuSCs的延伸和促炎因子表达密切相关。（这些实验只为证实：肌肉损伤=局部炎症反应=PGE2高表达）
为了探讨PGE2是否对MuSCs有直接促进增殖作用，作者发现，PGE2能够显著促进增殖（1F），为了进一步证实，随后血清中去除PGE2后增殖效果消失，加上后又回复这种增殖效果（这就是本文反复提到的gain- or loss-of-functionexperiments，体现实验严谨的地方）。随后，为了进一步支撑这个结果，作者进行了下面一系列实验：1采用延时显微成像系统记录了单个MuSCs在PGE2干预下的行踪（1G-1K），发现PGE2使得细胞更加活跃了；2 Clonalassays（具体没去查是个什么实验，但是可以看出这也是一个测增殖的实验）显示PGE2加速MuscS的更替（也就是说细胞生长更快的意思），而这一切是通过加快MuSCs有丝分裂，从而促进延伸（1G,1H）；3.PGE2处理组细胞的尺寸更大（1K）。
这么多实验就是证实一件事：PGE2促进增殖，（注意：本文增殖实验有哪些实验方法！）
02
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PGE2促进MuSCs细胞再生
这部分是体内实验，用来支撑结果1的结论的。作者从转基因小鼠上分离自带荧光片段和荧光素梅的MuSCs（GFP/luc），随后将这些细胞交联PGE2注射到损伤的胫骨前肌中（TA）；结果显示当然有效（感兴趣的可以了解下BLI ASSAY具体是个什么评估实验）：具体：把分离的带荧光标记的MuSCs注射后观察是否在损伤处稳定表达，随后进行2次损伤（黑蛇毒素和冷冻损伤）检测MuSCs体内荧光表达，他的多少可以反映MuSCs在体内的数量，也就是说PGE2处理后的在体内荧光值多些，意味着PGE2处理的MuSCs在损伤时候增殖更快，更有利于再生（2A）。同样，直接注射PGE2也显著促进损伤区域MuSCs的增殖（2B）（背景知识：作者选择PAX7来标记增殖的MuSCs，通过检测PAX7来定量）
背景知识： Pax7 是在卫星细胞中表达的标志性基因，肌肉卫星细胞，又称为肌肉干细胞，决定着骨骼肌的生长和再生。Pax7 和 MRFs （生肌决定因子）家族成员相互作用共同参与肌肉的生成和分化过程。其中，肌纤维形成过程主要包括活化、分化和融合三个阶段。
C,D结果说明PGE2使得再生增强，E:PGE2使得细胞尺寸变大，F,G是作者为了排除内源性的MuSCs干扰，采用PAX7基因敲除鼠，在TAM（他莫昔芬）注射后，即条件性敲除PAX7也就是把内源性的MUSCs排除，再外源注射MUSCS，再BLIassay评估（G），发现，荧光值还是增强。上述结果进一步证实，PGE2确实可以通过促进MUSCS增强肌肉组织再生能力。
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PEG2是通过EP4受体介导的信号来促进MUSCS增殖和融合
结果1和结果2是给足了证据证实PGE2可以促进再生，那么接下来就是讨论背后机制了。首先肯定是检测受体了，也就是作者发现作用后4个受体中EP4表达最高（3A），并且下游cAMP水平也升高（3B）。随后便是围绕EP4进行一个gain- or loss-of-functionexperiments，即，在PGE2的干预下抑制或者恢复EP4受体，检测对MuSCs增殖影响(3C),接下来在EP4基因敲除鼠上进一步验证MuSCs在损伤处的增殖（3D）和移植（3E）。
这一部分实验好理解，就是体内体外证实PGE2是通过EP4受体来发挥作用。实验很严谨，体内外结合，无可挑剔。作者引入cAMP，已知的EP4下游分子，间接也证实了PGE2-EP4-cAMP。后续可以通过观察cAMP水平也可以反映EP4或PGE2的处理变化（慢慢意会）。
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转录因子NURR1是PGE2/EP4信号通路下游mediator
作者找出了PGE2-EP4了，毕竟这个点还太浅，与本身的受体结合这个谁都可以想得到，做的并不深入，随后找出下游的作用分子，作者通过RNA-seq技术进行筛选（4A）。结合已知报道的与PGE2-cAMP有关的，最终筛选出NURR1分子。接下来就是证实NURR1这个分子在PGE2处理的变化了（常规思路：先qPCR检测确认PGE2处理后NURR1变化，随后，干扰NURR1后在PGE2干预下细胞的增殖变化等等）。4B: （体内）虎蛇毒素损伤后肌肉组织中NURR1的变化（和前面PGE2的一致），4C: （体外）MuSCs在PGE2处理下NURR1在mRNA（4C）和蛋白水平（4D）均升高。干扰NURR1后，PGE2的促增殖效果消失（E）.为了进一步确认NURR1是EP4下游分子，随后条件性敲除EP4小鼠上得到验证。（F,G）
结论： These data implicate thetranscription factor NURR1 as a mediator of PGE2/EP4 signaling that triggersMuSC expansion.
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PGE2信号的确实影响组织再生
已经验证了EP4是PGE2中间环节，那么敲除EP4也就是可以阻断PGE2信号传递了。A:敲除效率验证；B：敲除后eMyHC（eMyHC：未成熟纤维的标记，大量存在即可以理解为“夭折”）表达升高。D，E均是EP4敲除后，eMyHC的表达均上升（提示：Pax7 CreERT2: EP4 f/f 这个基因敲出鼠，意思是定点敲出MuSCs上EP4）。
然后接下来就是证实通过敲出EP4来阻断PGE2信号检测对肌肉强度的影响了，这里作者选了2个指标G和H：抽搐和破伤风力量（此处翻译可能不当：原文：twitch and tetanusforce）；后续实验也就是围绕这俩指标展开，同前面一样，只是不再使用基因敲除鼠了，采用的是NSAID非甾体抗炎药来抑制PGE2的合成。
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总结
思路简单；实验严谨
1.体内外验证PGE2在损伤时候高表达，且与增值再生密切关联----各路实验解释，反复证实
2.体内外验证机制---EP4—lose or gain function experiments
3.EP4下游机制----RNA-seq得出NURR1，验证
4.终极体内验证：阻断PGE2（EP4敲出和NSAID抑制合成）--观察
5.得出结论
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