斯隆-凯特琳姜学军：纯化一个分子到底有多难？

李莫愁说

武侠世界中的侠客们是不能在外面吃东西的，因为不是菜里有毒，就是仇家赶到，携手怒砸小饭馆。您要想补充点优质蛋白，要么找张三烤鱼，要么寻洪七公炖叫花鸡。想坐下来享受三斤已经高温蛋白变性的熟牛肉五斤18%的女儿红？take away吧～寻找蛋白真的这么难？
没错，寻找蛋白就是这么难！还记得莫愁读博时和团队小伙伴转一个质粒到感受态细胞里然后破碎细胞，分离纯化该质粒表达的蛋白酶。都已经做到最后一步了，但蛋白电泳一直没有出现目的条带……百思不得其解，浪费了一个周的时间重新纯化后，面对着除了marker以外空无一物的凝胶，莫愁决定把质粒送测，测序结果出来以后老师告诉我他拿错了质粒……
那么现在问题来了？当时的这一个多月莫愁到底在做什么……never mind！重要的是，莫愁的一位师兄竟然花了几十个月来纯化一个蛋白！想知道那几十个月到底发生了什么，赶紧跟随莫愁来独家揭秘！在这里也要感谢徐亦迅对采访稿的整理！
姜学军教授，现任职于美国Memorial Sloan-Kettering Cancer Center和康纳尔大学医学院。其实验室的研究主要集中在：（1）程序化细胞死亡（凋亡和铁死亡）的分子机制及其在疾病中的作用; （2）细胞自噬的分子机制及其在细胞死亡和癌症中的作用；（3）肿瘤抑制基因PTEN的翻译后调控研究。基于其基础研究的发现，该实验室也致力开发潜在的癌症治疗及診断方法。姜教授作为莫愁的师兄，受莫愁邀请接受专访并讲述了从一个蛋白的功能或者说一个分子的功能来purify一个未知的分子。
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介绍

姜学军教授，1993年获得复旦大学生物化学专业硕士学位，1999年获得美国Texas大学Southwestern Medical Center药理学博士学位，并在该医学中心有多年博士后经历，主要研究程序性细胞死亡方面的分子机制。2003年起转到美国Memorial Sloan – Kettering癌症中心细胞生物学部任助理教授，2009年起提升为副教授，2013起任细胞生物学部正教授。

姜学军博士实验室多年来主要从事与癌症生物学紧密相关的研究方向。其实验室综合利用生物化学、蛋白质组学、分子细胞生物学、高通量筛选以及小鼠动物模型等研究方法，致力于有关细胞凋亡、程序性死亡的癌症生物学基础研究，并潜力开发新的癌症治疗方法。

纪念斯隆-凯特琳癌症中心是世界上历史最悠久、规模最大的私立癌症中心。百年来，它一直致力于病人护理、研究创新，以及更好的理解、诊断和治疗癌症。作为美国最好的癌症中心之一，纪念斯隆-凯特琳癌症中心是美国41个被美国国家癌症研究院指定的综合癌症中心之一。在2014-15《美国新闻与世界报道》公布的的癌症专科评选中排名全美第一。

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采访内容

采访：李斌

整理：徐亦迅

李莫愁

根据功能来纯化蛋白的技术关键是什么？

姜学军

如果我们想要纯化一个已知功能活性的未知蛋白分子，有两个关键点需要特别注意。第一当然是活性检测方法，也就是我们常说的“assay”。我们希望这个活性检测方法具有很高的准确度和灵敏度，这对蛋白纯化能否成功最为重要。第二就是起始原料（starting material），选择从哪种器官/组织/细胞里来纯化这种活性。比如说这种活性在肝脏里较高，而在心肌里较低，那么选择心脏组织或细胞为起始原料就显然不明智。

由于我们是在和一个未知的活性分子打交道，纯化过程中还有很多潜在的不可控因素。比如该分子的丰度如何，以及它在不同的溶液里面稳定性怎样。通过一系列的预初实验，如果你有很好的活性检测方法，就可以先去摸索这些条件，这些都是做蛋白纯化重要的前期准备工作。

李莫愁

为什么有些蛋白特别难以纯化？

姜学军

说起纯化不同活性的难易程度，丰度低或者稳定性差的分子显然相对难被纯化。如果想纯化的活性是膜蛋白，其难度相比水溶性蛋白通常要更高。首先我们需要把膜蛋白用去垢剂(detergents)来溶解，确认所使用的去垢剂不会破坏或者掩盖它的活性，这也是很难控制的因素，要通过实验去摸索。

另外，如果想纯化的活性需要多个蛋白分子，那么其难度也会很高。因为所需要的几个蛋白一旦被拆分到不同组分里，每个单一组分都会丧失活性，要将这些组分重组才能恢复活性。一个非常著名的例子就是王晓东教授当年用蛋白纯化的手段发现由线粒体介导的细胞凋亡通路。当时他遭遇的问题是（也是其纯化工作超难度之处），他发现这个通路需要多个因子。所以他首先把这些因子成功地分到不同的组分里以便各个纯化，然后再把它们重新组合。整个纯化过程需要多次使用“加减法”：首先拿到Cytochrome c，其次获得Apaf-1，最后拿下Caspase 9。 他的这一被载入教科书的工作，不仅生物学意义重大，同时也是生物化学纯化的一个经典案例。

从历史发展的角度来看，上世纪的蛋白纯化工作比现在要难得多，其中有很多的原因。首先是早年的仪器和层析柱等工具都不如现在这么好，其次是当时的纯化多数是以动物的脏器为起始原料。动物的脏器有很多的劣势，比如里面的脂类含量一般很高，想要获得很纯清的蛋白溶液过程比较难。还有就是动物脏器匀浆里面的蛋白酶活性相对比较强（溶酶体被破坏），在纯化的过程中如果操作不是最快最好的话，你的目标蛋白就已经慢慢地被降解掉了。在目标蛋白的鉴定上，当时需要很大量才能成功。而且在凝胶电泳上如果不是单一条带，也很难搞清究竟是哪一条代表了目标活性 。后来的技术进步除了有更好的仪器和层析柱以外，我们的起始原料也开始更多使用组织培养的细胞，比如HeLa细胞，这些样品相对非常干净 。而且如果溶酶体保护得好的话，目标蛋白在纯化过程中被降解的概率会大大降低。现代的质谱和蛋白组学技术可以非常灵敏快速地鉴定出总量不高的候选蛋白。即使纯化结果还不是尽善尽美，我们通过细胞分子生物学或重组蛋白等技术从几个或者更多个候选蛋白中来迅速验明目标活性蛋白的“正身”也并非难事。因此如今的蛋白纯化工作相对来说比以前要容易很多。

李莫愁

历史上有没有需要超巨量起始原料才能纯化成功的例子？

姜学军

一个著名的例子就是细胞分裂成熟促进因子MPF (maturation-promoting factor) 的发现。后来我们知道这其实是一个由两个蛋白亚基组成的异二聚体：CDK1加上Cyclin。根据名人轶事的说法，日本科学家増井祯夫(Yoshio Masui)在纯化这一活性过程中总共使用的蛙卵粗提液，可以装满一个游泳池！増井的实验非但起始原料特殊，而他的检测方法更是非比寻常：需要将提纯液微注射入细胞周期阻滞在G2期的青蛙卵细胞中，通过被注射细胞能否进入M期来定量MPF的活性。

李莫愁

还有其它需要补充的吗？

姜学军

也需要指出，有时候被纯化的活性背后不一定是蛋白质，所以我们在纯化一个未知生物活性时的严格用语是：”purification of a novel biochemical activity”, instead of “purification of a novel protein or protein complex”。虽然多数时候所发现的活性确实是一个或多个蛋白分子，有时候却会是其它类型的分子。在文献里不乏这样的例子（一个典型的例子是第二信使cAMP的发现）。

生物化学活性纯化极具挑战而又令人兴奋。如果目标活性是你很感兴趣的并且兼具生物学意义，一旦成功，其成就感妙不可言。

遗憾的是（或者我应该说“幸运的是”？），随着大量新的替代技术手段涌现，当前还在把纯化作为发现工具使用的科学家已经越来越少。这个技术已渐渐成为“Lost art”，其用途可以被很多新技术很有效地代替。但是我想说的是（作为一个受过传统生物化学训练并乐此不疲的人，我的观点大概是很具偏见可被忽略的）：在一些特殊的场合下，经典的活性纯化技术还是有其独特的优势的。

感谢姜教授接受专访，也感谢徐亦迅帮忙整理采访稿（由于本文篇幅所限，莫愁只公布部分）

Rome was not built in a day

条条大路通罗马，莫愁认为这个命题本身就是不对的。为什么一定要去罗马？在罗马还没有建成之前去哪里？20年前的整个生物医学世界远没有现在那么发达，许多现在已经十分浅显、成为基础的知识，在那时可能都需要日以继夜的艰苦研究才能获取、认知。那时候没有所谓的基因组，也没有一大堆其他的工具。那时候设法拿到一个小分子的identify，也是非常非常难的。同样一个人可以用大约2小时的时间跑完菲迪皮茨人生最后一段路程，也可以驾车几首歌的时间轻松抵达。后者只是享受到了前人的智慧成果，前者却创造了历史。

回想所有的一切，从古至今，永远都是强者、智者掌握世界。历史只是他们的玩物。就像叙利亚是世界列强的玩物！决定敘利亚命运的是强者，但是承受结果的是当地的人，不管你什么族群、宗教。

决定分子命运的也不是分子自身，而是伟大的科研工作者。而我们更应该庆幸和钦佩做出改变，并且是好的改变的人！