细胞周期性依赖激酶(CDK)抑制剂因其在细胞内重要的功能，成为近20年来研究的热点。最近CDK9成为癌症治疗药物开发的炙手可热的可药性靶点。CDK9介导的短存活抗凋亡蛋白的转录调控对于转基因细胞的生存至关重要。基于多样性骨架(scaffold)的化学库筛选在选择性CDK9抑制剂的开发方面取得了多方面的成功。本文综述了CDK9的调控、细胞功能、靶向CDK9的常用核心结构及其在体内外的选择性和有效性。自伊马替尼获批以来，美国食品药品监督管理局(FDA)已批准28种小分子激酶抑制剂。近15年来，一些细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂(2-13)进入了治疗癌症的临床试验(图1)。2015年2月，FDA批准了有史以来第一个用于治疗转移性乳腺癌的CDK抑制剂帕博西尼 (PD-0332991，化合物1)的加速批准。1在体外对CDK4/6激酶比其他CDKs具有> 2个数量级的选择性，其选择性归因于C2位的氨基吡啶取代。这给该领域注入了活力，为选择性CDK抑制剂小分子的开发提供了信心。CDKs是Ser/Thr激酶亚家族的成员。细胞周期蛋白类是与CDK结合的调节亚基，导致激酶的激活。CDK家族的大多数成员组成CDK/cyclin复合物，参与细胞周期或转录的调控。CDK5是一个例外，因为它与一个非环素蛋白调节因子结合，不参与细胞周期或转录RNA加工的调节。人类基因组编码21个CDKs(1-11a, 11b-20)和15个以上的细胞周期蛋白类(A-L、O、T和Y)。参与细胞周期调控的主要CDKs和细胞周期蛋白类分别为1、2、3、4、6和A、B、D、E。CDK-1,2,4和6以及细胞周期蛋白类D和E通过G1期参与细胞周期的调控。CDK-1、2、3以及细胞周期蛋白类A、B和E参与S、G2和M期的调控。CDK-7、8、9和11以及细胞周期蛋白类C、H、L和T是转录调控RNA加工的关键分子。激酶结构域内部的高度结构同源性，特别是在CDKs中，为CDK特异性小分子抑制剂的发现提供了机会。尽管如此，超过95%的FDA批准的激酶抑制剂瞄准了激酶域内的ATP结合位点。表1总结了一组CDK抑制剂的体外选择性概况，其中包括几个正在进行临床试验的CDK抑制剂。表1. CDK抑制剂的选择性
RNA聚合酶Ⅱ(RNAP)最大亚基的羧基端结构域(CTD)含有七肽重复序列：YS2PT4S5PS7。序列中丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化被CDK7和CDK9紧密配合以调节转录和mRNA剪接。CDK9对RNAPⅡ上Ser2的磷酸化被用作临床前药效学研究的标记物。以CDK9为靶点的肿瘤病例是基于CDK9调节短寿命抗凋亡蛋白RNA转录的观察。抑制CDK9介导的CTDRNAPII磷酸化，导致Mcl-1和XIAP等抗凋亡蛋白水平降低，从而恢复癌细胞，特别是淋巴细胞白血病细胞发生凋亡的能力。
转化细胞沉迷于抗凋亡蛋白的持续表达。由此，提出了瞬时抑制CDK9阻断这些抗凋亡蛋白转录的假说。这在一个优雅的基于细胞的筛选级联中得到了验证，该级联旨在从生化和表型上区分通过抑制转录CDKs而诱导抗增殖效应的化合物和抑制细胞周期CDKs的化合物。以p53蛋白水平和有丝分裂指数分别作为转录CDK抑制和细胞周期CDK抑制的读数。研究表明，瞬时抑制CTD RNAPII在转化细胞和非转化细胞中的磷酸化水平相似，仅在转化细胞中诱导半胱天冬酶依赖性凋亡。
现就近年来利用RNAi方法与小分子抑制剂一起界定CDK9在癌症中作用的研究进行综述。CDK9通过下调FLICE样抑制蛋白(c-Flip)和Mcl-1瞬时下调肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)致敏HeLa和A549细胞。一个CDK抑制剂4 ( SNS-032)与TRAIL联合治疗在一个肺癌模型中表现出协同抗肿瘤作用。在肝细胞癌( HCC)细胞系中，shRNA介导的CDK9的敲除显示了一系列与敲除效率或增殖率无关的反应。而且，与小分子抑制CDK9相比，敲低CDK9并没有诱导细胞凋亡，反而抑制HCC细胞系的增殖。在头颈部鳞癌细胞系中，CDK9的敲低或小分子抑制剂的抑制导致放射增敏，而CDK9的过表达则提供放射保护。在卵巢癌细胞( A2780)中，敲低CDK9的shRNA或用CDK抑制剂黄皮苷(CDKI-73,8)处理细胞，均可诱导细胞凋亡。在一项细胞活力研究中，与野生型A2780细胞不同，8在24 h时间点对CDK9敲低细胞无影响，表明CDK9具有选择性。然而，在72 h时间点敲低CDK9对8诱导的生长抑制没有影响，可能是由于脱靶效应。这些研究表明，与CDK9抑制相关的抗癌作用取决于CDK9的功能如何被抑制，包括研究中使用的细胞类型以及与CDK9抑制相关的动力学。
Gran实验室通过化合物(8)和显性负性CDK9对胶质母细胞瘤细胞系(T98G)进行基因表达谱检测，以确定CDK9抑制的差异效应。激酶死亡CDK9显性负(DN)突变体在细胞中的表达使野生型CDK9从各种细胞复合物中移位，使其催化失活。他们观察到DNCDK9抑制CDK9的基因表达与8处理相比差异显著。
在后续研究中，他们使用永生化的正常成纤维细胞和原代人星形胶质细胞，同时用siRNA调节CDK9活性，以尽量减少与前期研究相关的固有技术问题。结果证实CDK9抑制方式对基因表达模式有显著影响。虽然8种治疗方案和DN-CDK9和CDK9 siRNA治疗方案影响的共同基因数目较少，但与研究中使用的细胞类型相比，聚类分析显示治疗方案之间的相关性更高。
布拉西耶实验室最近的报告为CDK9作为靶点的验证增加了另一个变量。在静息细胞中，CDK9活性低和高的复合物以~ 1:1的比例存在。这种分布被包括呼吸道合胞病毒( RSV)感染在内的多种刺激改变，从而触发复合物组成的改变，增加CDK9高活性复合物的数量。通过对静息和poly (I:C)刺激的肺癌细胞(A549)进行差异定量蛋白质组学研究，获得CDK9相互作用组的全貌。在CDK9互作子中发现591个蛋白，其中包括~70%的新型高信赖蛋白。这一研究拓展了CDK9在mRNA前剪切和mRNA转运/翻译中的作用。很明显，CDK9参与多种细胞功能的调节，其中许多对癌细胞生存至关重要。
Anastassiadis 等报道了一个包含178个小分子激酶抑制剂的大规模筛选，其中包括FDA批准的药物、临床前开发的小分子抑制剂以及代表所有主要激酶家族的300个蛋白激酶的临床抑制剂。61个屏幕包括以下细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白类：CDKs1、2、3、4、5、6、7和9；细胞周期蛋白类A、B、D1、D3、E、H、K、T1以及CDK5激活剂p25和p35。我们分析了这些数据并得出了CDKs之间的相关系数(表2)。系数为1将意味着文库中的抑制剂无法区分相应的CDK/cyclin复合物。CDK2/cyclin A和CDK5/p35的r2值最高为0.91，CDK7/cyclin H和CDK9/cyclin T1的r2值最低为0.12。
表2.多样性库中激酶抑制剂对CDK的相关性系数
在这178个抑制剂中，有7个在改实验条件下对CDK9/cyclinT1和CDK9/cyclin K均表现出> 75 %的抑制作用。7种抑制剂中6种(14-19)均为CDK9/cyclinT1和CDK9/cyclin K的共同抑制剂(图4)。在75 %抑制标准的基础上，鉴定为CDK9抑制剂的6个化合物(14-19)也分别抑制7 %、40.3 %、3.3 %、24.6 %、39.3 %和71.3 %的激酶。6种抑制剂中，化合物16选择性最高，仅抑制3.3 %的激酶，化合物19选择性最低，抑制300个激酶的71.3 %。
图4. 抑制CDK9/cyclinT1和CDK9/cyclinK复合物激酶活性的化合物迄今为止，为开发CDK9抑制剂所探索的核心结构包括色酮、嘧啶、吡唑、咪唑、嘌呤和噻唑。此外，本文将在此讨论临床前和临床发展中的特异性化合物。几乎所有的核心结构都通过与铰链区域残基的相互作用锚定在CDKs上(图5)。中间残基(一个疏水残基和一个酸性/碱性残基)的羰基上的骨架氧原子和酰胺上的氢参与锚定小分子抑制剂。设计该区域以外的官能团，针对激酶之间不同的ATP结合位点内的裂口，可产生选择性的小分子抑制剂。几乎所有的研究都采用体外无细胞激酶实验来证明选择性。这是因为设计原理使用共晶结构来生成具有更好选择性的模拟物。这些研究很少显示细胞基系统的选择性。这一点很重要，因为大多数激酶都是较大的复合物的一部分，而体外激酶实验可能无法准确地捕捉到复合物中激酶所采用的构象。化合物8为生物碱类天然产物，经鉴定为CDK抑制剂，对多种癌症具有生长抑制活性。尽管8临床前研究很有希望，但Ⅰ/Ⅱ期临床试验的结果并不令人鼓舞。急性髓系白血病(AML)是一种以未成熟髓系前体细胞异常聚集为特征的血液恶性肿瘤。AML患者对常规化疗药物反应差。7 + 3仍是美国新诊断AML患者的标准诱导治疗。最近，一项Ⅱ期研究表明，FLAM [8联用阿糖胞苷和米托蒽醌]诱导治疗可使初诊高危AML患者的缓解率提高近67.80 %。化合物8已被授予治疗AML的“孤儿药”。迄今为止，以8抗多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、实体肿瘤为单一药物或与其他药物联合进行了60项临床试验。8与CDK2的共晶结构揭示了其可以作为ATP竞争性抑制剂，随后的研究表明8抑制转录，Price实验室的研究表明8是与CDK9紧密结合的非ATP竞争性抑制8与CDK9/Cyclin T1复合物的晶体结构表明，8与ATP结合位点的确结合，仅有约8 %的表面暴露(图6A)。8中的2 -氯苯基在CDK2上与CDK9发生了有利的静电接触。在CDK2抑制剂8共晶结构中，Lys89 (图6C)残基被转移到可以容纳8的位置，Gly112使CDK9的这种转移没有必要。
此外，在CDK9中，甘氨酸富集loop(残基27-36,图6B)折叠在活性部位上，与抑制剂8作用的疏水性残基(Ile25和Val33)之间促进范德华接触(图6B)。甘氨酸富环中的Phe30残基移动，与抑制剂8的哌啶基形成额外的疏水接触。8结合后，β3/αc的loop(残基51-55,图6B)的这种主要构象变化将G-loop锁定在一个“封闭”构象中，从而解释了CDK9的紧结合。化合物8通过抑制CDK9的活性抑制HIV-1 tat的转录激活和病毒的复制。然而，在长期复制实验中，8在生理相关的细胞类型，即外周血淋巴细胞(PBLs)和单核细胞来源的巨噬细胞中显示出更低的抗病毒效果和更强的细胞毒性。针对这一问题，为提高选择性，一系列8的类似物被合成出来，并在无细胞和基于细胞的检测中进行了评价(表3)。类似物8对CDK9的抑制作用强于CDK2，提示苯并吡喃酮的2位苯环上取代基的大小和位置对体外活性和选择性有影响。有趣的是，在基于细胞的细胞毒实验中，降低2位的疏水性会导致活性的显著下降。 表3.抑制剂8靶向CDK9活性
化合物9 (图1)是一个基于黄酮的小分子，选择性地抑制CDK-1、4和9。它以纳摩尔级别的活性(IC50≈300.800nM)抑制癌细胞生长，对正常成纤维细胞表现出良好的选择性。生化研究表明，9抑制RNA聚合酶Ⅱ磷酸化，下调Mcl-1。化合物9已有11项治疗多种癌症的临床试验，包括单一药物和与其他药物联合。
嘧啶是在多个激酶抑制剂中发现的一种特权核心结构，阿斯利康探索了氨基嘧啶核来开发CDK抑制剂。虚拟筛选后再进行基于结构的设计，鉴定出了4- (2,4-二甲基噻唑-5-基)嘧啶-2 -胺(化合物37)为CDK抑制剂。以此为出发点在一系列报道中，Fisher和Wang小组讨论了他们的SAR结果和CDK-小分子抑制剂共晶结构，从而导致在一组癌细胞系的3天细胞基础生长抑制实验中发现了一个强效的CDK2/CDK9抑制剂38，具有低纳摩尔Ki值(体外)和纳摩尔(~ 300nM) IC50值(图7)。后续研究采用基于细胞的表型筛选级联反应将嘧啶类似物分为转录组、细胞周期组和有丝分裂抑制组。SAR数据支持CDK9的抑制导致RNA聚合酶Ⅱ的Ser2磷酸化减少，足以抑制转录的假设。进一步优化导致在动物模型中鉴定39为对CDK9具有抗肿瘤活性的选择性转录抑制剂(图7)。对三取代嘧啶核进行了额外的SAR研究，导致在CDK7和CDK2上分别鉴定出~10和~20倍选择性CDK9类似物40，108 (图7)。进一步优化得到20为先导化合物，对CDK9具有~80倍的选择性超过CDK2。20类似物结合能力与黄皮酚相当。重要的是，铅候选物20对正常B和T细胞之上的原发性慢性淋巴细胞白血病细胞具有~31 -和~107倍的选择性。表4. 嘧啶含有天然产物和类似物以及激酶抑制活性
大环是一类未被充分开发的药物分子，它提供了相对固定的结构和足够的灵活性，可以在不损失主要的熵的情况下，实现结合最大化。初始大环命中49被进一步优化，得到化合物50。最初，50被报道为CDK2、JAK2和FLT3抑制剂。它抑制CDK-1、2、5、7、9、JAK2和FLT3下游的信号通路(图10)。化合物50通过CDK9抑制表现出抗肿瘤活性，导致Mcl-1水平降低，在广泛的肿瘤细胞中导致p53独立凋亡。化合物50目前在Ⅰ期临床试验中评价为慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者单剂，与卡非佐米联合治疗多发性骨髓瘤患者。化合物50的细胞毒性机制与ABT-737和venetoclax存在补偿机制，因此在AML患者样本中产生了稳定的协同活性效应。采用以药效和耐受性为参数的体内筛选方法，确定了吡唑[1,5-a]嘧啶基化合物11为CDK抑制剂。化合物11 (图1)在体外能有效抑制CDK-1、2、5和9活性，IC50值分别为3、1、1、4 nmol/L。默克使11进入难治性慢性淋巴细胞白血病(CLL)Ⅲ期发展。11能有效下调CLL细胞Mcl-1的表达，拮抗CLL微环境中重要的多种可溶性蛋白介导的保护作用。最近，通过基于结构设计和SAR研究，鉴定出一种新型嘧啶基可逆ATP竞争性抑制剂51 (图11 , LY2857785)为选择性转录CDK抑制剂(CDK9 IC50=11 nM，CDK8 IC50=16 nM，CDK7 IC50=246 nM)。生化和细胞周期研究认为转录抑制是其作用方式。此外，51对115个激酶的面板具有良好的整体选择性，水溶性高，溶液稳定性好，理化性质优良。抑制剂51在体外和体内具有与8相当的效价，在肿瘤细胞系中显示出良好的抑制活性，但在AML和其他血液病类型(IC50 < 50 nM)中活性最高。Western blot分析显示血液病癌细胞系抗凋亡蛋白Mcl-1和XIAP水平下降。然而，体外人骨髓集落形成实验和动物毒性研究表明，51可抑制正常造血细胞增殖，且呈剂量和时间依赖性。化合物51的动物毒理学研究显示对骨髓和胃肠道等关键器官具有剂量依赖性毒性，从而限制了其临床应用。氨基吡唑是ATP中许多能有效模拟腺嘌呤环的核心结构之一，取代氨基吡唑已被发现可以作为CDK抑制剂。在家用文库筛选中鉴定了一个芳基偶氮取代-1H-吡唑-3，5 -二胺作为CDK抑制剂。后续合成和评价了一个聚焦芳基偶氮取代-1H-吡唑-3,5 -二胺文库，确定21为ATP竞争性CDK抑制剂，可减少Rb和CTD RNAPII的磷酸化。化合物21对CDK2和CDK9的增强作用分别归因于酚醛氢与Glu51和Glu66之间的氢键作用(图12)。以结构导向的片段为基础的研究确定了一个吲唑核作为ATP竞争性CDK抑制剂。通过去除融合苯环截断吲唑，简化了吡唑核，具有相似的配体效率。吡唑核的结构导向优化发现了临床候选物5 (AT7519 ,图 1)。在多发性骨髓瘤细胞中，5表现出强大的细胞毒性，诱导细胞凋亡，抑制RNA聚合酶Ⅱ。体外激酶谱显示，5是ATP竞争性抑制剂，其细胞毒作用归因于CDK9、CDK5和GSK3b的抑制。吡唑类CDK9 (IC50 < 10 nM)抑制剂5已被用于治疗套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤的Ⅱ期临床试验。抑制剂52 (RGB-286638)是一种以茚并吡唑为核心的泛CDK抑制剂(图12)，在治疗实体瘤的Ⅰ期临床试验中得到评价。体外激酶谱显示52为强效CDK9抑制剂，抑制剂52为半胱天冬酶依赖性凋亡，与下调RNA聚合酶Ⅱ和抑制转录有关，提示CDK9抑制为主要作用方式。Bcl-2家族成员Mcl-1是多种肿瘤细胞生存和凋亡的关键驱动因子。在AML患者中，Mcl-1过表达与预后不良有关。而且，Mcl-1对于具有多样遗传病变的小鼠AMLs的启动和持续体内生长至关重要。这些研究为筛选出下调Mcl-1水平的激酶抑制剂奠定了基础。本研究鉴定了一个先前已知的抑制CDKs的PI3Kα抑制剂53 (图13)，作为间接的Mcl-1抑制剂。生化研究表明，53是CDK2 ( Kd = 540nM)、CDK7 (Kd = 2.5nM)和CDK9 (Kd = 4.1nM)的ATP竞争性抑制剂。为了改善选择性剖面，SAR研究导致了以吡唑并嘧啶为核心的类似物54和23。模型研究表明，吡唑并[1,5-a]嘧啶占据CDK9的ATP结合位点，2,5 -取代芳基直接导向磺酰胺基团的取向。关键的相互作用包括卤素与Phe103残基的π相互作用。然而，将Br原子替换为Cl原子后，其亲和力显著降低。这与用CN(54)取代NO2基团(53)翻转选择性有关。54中代谢活性弱的腙连接子，23中被稳定的脂肪族氨基连接子取代后，在保持CDK9选择性的同时降低了活性。在寻找用于癌症治疗的CDK抑制剂方面，诺华制药鉴定了一个吡嗪基吡啶类化合物。合成了278个化合物的聚焦文库，并对其作为CDK9抑制剂进行了评价，鉴定了一个低nM抑制剂55 (图14)。第二次迭代将该类内的额外类似物(56，57和25)鉴定为选择性提高的CDK9抑制剂(图14)。诺华制药药物系统地优化了联吡啶类化合物(58-61)，从而产生了强有力的CDK9抑制剂(图14)。苯基三嗪是一类含有二芳基与一个苯基环和一个三嗪环相连的分子。苯三嗪类似物已被探索用于癫痫和双相障碍的治疗，拜耳研究组鉴定苯三嗪类似物为强效CDK9抑制剂(表5)。这些抑制剂( 62-66)在一组癌细胞系(HeLa、DU145、Caco-2和B16F10)中表现出优异的细胞活性。 表5. 苯三嗪类似物及其抑制活性
嘌呤核在激酶抑制剂的开发中得到了广泛的探索。三取代嘌呤是第一个被开发为癌症治疗药物的CDK抑制剂之一。化合物2是一个CDK抑制剂，其作用靶点是CDK-1、2、4、5和9。化合物2是第一个进行多阶段Ⅰ、Ⅱ期临床试验的CDK抑制剂。半衰期短和新陈代谢迅速被认为是2在诊所缺乏成功的原因。这些问题通过反复的SAR研究得到解决，结果发展了多个2类似物作为临床候选人。CDK9与化合物67 (图15)的共晶结构表明，嘌呤环上的N-7和C-6上的氨基通过氢键与铰链区的Cys106残基相互作用。67的嘌呤环夹在疏水残基Ile25和Leu156之间，苯基吡啶暴露在溶剂中。67结合后，有一个甘氨酸富环向下运动，以遮挡抑制剂结合位点。像其他抑制剂一样。CDK9的结构，67结合后的构象改变部分解释了CDK9选择性的来源。CDK9存在于无数对转录调控重要的细胞复合物中。有几项研究描述了CDK9在转录的不同方面的作用。鉴于CDK9在转录中的核心作用，很可能不同的异构体定位于不同的复合物，具有细胞类型特异性功能。目前，有充分证据强烈支持CDK9作为癌症靶点。比较apo- CDK9与抑制剂结合CDK9的结构研究表明，CDK9中ATP结合位点的几个片段如铰链区、G-loop和Cα-螺旋比CDK2等其他CDK更灵活。这种灵活性可能是CDK9适应不同复合物中不同结合环境的关键。因此，在任何特定时间，小分子CDK9抑制剂可能只针对含有CDK9的复合物的一个子集。这可以被适应到一个筛选系统中，在这个系统中，潜在的治疗药物通过体外复合物的面板进行测试，以确定它可能对细胞产生什么影响。
抗癌作用的机制是围绕CDK9对维持Mcl-1等短存活抗凋亡蛋白水平升高至关重要这一观点而融合的，一部分癌症需要这样才能生存。由于Mc-1依赖CDK9的功能，目前已广泛报道CDK抑制剂与BH3类似物之间存在协同作用，为靶向CDK9提供了更多的价值。我们以前的研究表明，间接调节Mcl-1的小分子可以诱导肿瘤对直接抑制Bcl-xL的敏感性。化学遗传学筛选发现，诱导凋亡的激酶抑制剂分别以Mcl-1依赖或Bcl-xL依赖的方式聚集CDK和PI3K抑制剂。这与最近报道显示11和MK-2206 (Akt抑制剂)协同抑制患者移植瘤模型胰腺肿瘤生长和转移相一致。普遍观点是，特异性CDKs选择性的提高将导致更好的癌症治疗。一些综述比较了8和2是泛CDK抑制剂的临床结果，其中化合物1是FDA批准的CDK4/6抑制剂，以支持上述说法。然而，最近的一项化学蛋白质组学研究显示，最近批准的CDK4/6抑制剂，1是一种强效的CDK9抑制剂，同时也参与脂激酶的作用，而一个结构相关的类似物12则没有。
这些研究强烈反对将CDK9抑制剂相关的某些脱靶效应工程化，特别是那些将下调Bcl-xL等其他抗凋亡蛋白水平的效应。但是，某些靶外效应，如抑制正常细胞生长是不可取的，应该避免。这些观察以及SAR研究中非细胞和细胞活性相关性较差，表明需要额外的全面的临床前和临床研究来确定是否改善给定CDK抑制剂的选择性剖面会产生有效的癌症治疗效果。
参考文献：
Sonawane Y A, Taylor M A, Napoleon J V, et al. Cyclin dependent kinase 9 inhibitors for cancer therapy: miniperspective[J]. Journal of medicinal chemistry, 2016, 59(19): 8667-8684.
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