光反应氨基酸

L-光反应-亮氨酸（L-Photo-Leucine）和L-光反应-甲硫氨酸（L-Photo-Methionine）是L-亮氨酸和L-甲硫氨酸氨基酸的类似物，具有可被活化的双吖丙啶侧链，当暴露于紫外光照射时能够与邻近的分子进行化学交联。与它们天然存在的对应物一样，这些光反应活性氨基酸在蛋白合成时可以被内源性地整合到蛋白的一级序列中。这些合成的蛋白，其在天然环境中参与蛋白-蛋白相互作用结构域可以通过激活双吖丙啶基团进行共价交联。传统的交联实验需要加入双功能性化学交联剂以及相关的试剂溶剂，它们对所要研究的细胞生物学内容有不良影响。使用光反应活性氨基酸可将这些潜在的不良影响最小化，使所要研究和鉴别的细胞中的稳定的及短暂的蛋白相互作用高度可信。当与不含亮氨酸和甲硫氨酸的特殊配制的限制型细胞培养基联合使用时，蛋白合成机制会将光反应活性衍生物像其天然存在的氨基酸进行同样处理。因此，它们可以在蛋白一级序列中取代亮氨酸或甲硫氨酸。当暴露于紫外光（见紫外灯，下页）时，双吖丙啶环形成有活性的反应中间体，与邻近蛋白的侧链和骨架形成共价键。天然关联结合的配体便立即被捕获。交联的蛋白复合体通过在SDS–PAGE 中迁移率降低而被检测，随后进行Western blot 检测，分子排阻色谱，蔗糖密度梯度沉降或质谱检测。

光反应活性氨基酸交联和甲醛交联是用于蛋白相互作用分析的互补技术。Hela细胞进行模拟处理（第1道），使用1%甲醛处理10 分钟（第2道），或使用光-甲硫氨酸和光-亮氨酸处理后进行紫外线处理（第3道）。细胞裂解后每个样品取10μg 进行SDS-PAGE和Western blotting分析，使用抗hsp90，STAT3，Ku70 和Ku86抗体。以β-actin和GAPDH印迹作为上样对照。

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小编：wyf  2020.10.27