在宏基因组库中发现的热稳定性酶PET2已被设计用于提高其对聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET) 的水解活性。野生型PET2 (WT) 的Tm为69.0°C，在60℃下，以0.40min–1 的速率从无定形PET薄膜中产生水溶性反应产物 (反应60分钟后, 0.1μM酶, 生成2.4μM产物）。通过表面电荷优化、骨架稳定、和额外二硫键引入等策略设计PET2突变体，其中最佳突变体 (PET2 7M) 的Tm值为75.7℃，PET水解活性达到1.3min-1 (60℃下，0.1μM酶，反应60min，可以产生7.8μM水溶性产物)。相较于PET2 WT水解无定形PET的最适温度60℃，PET2 7M水解无定形PET的最适温度提高了8℃ (68℃)。相较于PET2 WT (0.40min-1), PET2 7M在最适温度下的水解活性提高了6.8倍 (2.7min-1, 0.1μM酶，反应60min，可以产生16.2μM水溶性产物)。此外，在68℃下，PET2 7M可以恒定的速度生产产物24小时，这一结果预示着PET2 7M可以在最适温度下长期保持稳定。
01
PET2 WT热稳定性和最适pH值评估
PET2 WT与BHET (一种中等水溶性PET组分) 一起孵育，并通过HPLC对产生的MHET进行定量 (注意：实验条件下未检测到TPA)。在pH 7.0的条件下，40℃-90℃的不同温度下分别处理1小时后，通过参与酶活性来评估PET2 WT的热稳定性。到达65℃时，其降解活性可以保留至1.3 S-1。另一方面，温度高于70℃时，几乎没有残余酶活保留 (Figure 1A)。为了评估PET2 WT的最适pH值，在60℃条件下，测定了其在pH 3.0至10.0的PET降解活性，发现在pH 6.0和7.0时降解活性最高 (Figure 1B)。因此，60℃和pH 7.0被用于标准反应条件。
Figure 1 PET2 WT性能评估
为了进一步评估PET2 WT的热稳定性 (Tm)，首先利用圆二色谱 (CD) 测定了PET2 WT在20℃和95℃的CD谱图。如Figure 1C所示，PET WT在20℃和95℃时，α-螺旋和β-折叠对应的222 nm和215 nm处的信号差异不大，而在95℃时，色氨酸对应的230 nm处的信号有一个向下的峰，故PET2 WT的Tm值根据色氨酸在230 nm处信号来计算。结果如Figure 1D所示，PET2 WT的Tm值为69℃，此结果与Figure 1A的热处理结果一致。
Figure 2 在CaCl2存在下PET2 WT降解无定形PET薄膜
在Ca2+存在下，角质酶LCC、TfCut2和Cut190的热稳定性和PET降解活性都有显著的增加。故此，作者评估了PET2 WT对于Ca2+的依赖性。结果如Figure 2所示，与未加Ca2+时相比，在Ca2+浓度分别达到10mM、100mM和300mM时，PET2 WT的PET降解活性并没有显著性的变化。基于以上结果，作者后续的实验都在未加Ca2+的情况下进行。
02
突变体设计改造
作者首先通过同源建模获得PET2 WT的三维结构，此结构用于后续突变体设计。作者主要基于4种突变体设计策略进行单点突变体设计：1）基于IsPETase结构特性进行单点突变体设计；2）脯氨酸突变体设计；3）对催化三联体附近的四个连续甘氨酸进行突变体设计；4）二硫键设计。
基于IsPETase的表面结构特征以及之前报道的能够提高活性的IsPETase突变体 (Figure 3A)，作者分别引入了碱性氨基酸和其他单点突变体。结果如Figure 3B (橙色菱形) 所示，其中突变体F105R和E110K的Tm增加了1℃以上，PET降解活性分别增加了1.5和1.4倍。L298R与F105R和E110K两个突变体位于同一表面，但在IsPETase表面并没有比对到此位点，L298R突变体的Tm值和PET降解活性都有降低。而在基于IsPETase工程化突变体的设计之中，Q183R和Q134Y突变体的活性增加。然而，Q183R突变体的Tm值却降低了，至于Q134Y突变体的纯化量非常低则是由于尺寸排阻色谱 (SEC) 过程中洗脱时间的显著推迟。此外，S202Q和S155D突变体的Tm增加了，活性却下降了。
脯氨酸突变广泛应用于蛋白质热稳定性改造之中。在此，基于PET2 WT同源建模结构，作者选择了具有合适脯氨酸二面角的氨基酸残基位点进行了脯氨酸突变。结果如Figure 3B (绿色圆圈) 所示，突变体S156P和T297P的Tm值提高了1-2℃，而突变体D53P和A192P的Tm值低于PET2 WT。除了A192P的PET降解活性只有不到PET2 WT的一半，其他突变体的PET降解活性均与PET2 WT的差异不大。
Figure 3 每个PET2突变体对应的Tm值及无定形塑料降解活性
多种PET降解酶存在着一个共同的结构特征，即在酶的催化三联体附近存在一个由四个甘氨酸组成的α-螺旋。而相比于含有丙氨酸构成的α-螺旋，这种甘氨酸构成的α-螺旋是不稳定的。故此，作者对Gly177-Gly180四个位点进行了丙氨酸突变。结果如Figure 3B (蓝色三角) 所示，G180A突变体的Tm值和PET降解活性分别提高了2.6℃和1.5倍。而其他三个突变体的Tm值和PET降解活性都低于PET2 WT。
额外二硫键引入的策略广泛应用于提高蛋白质热稳定性，作者在蛋白的C-端和N-端设计了四对二硫键 (Figure 3B 紫色倒三角)。R47C-G89C突变体的Tm值为72℃，相较于PET2 WT提高了3℃。C-端的两对二硫键突变体 (Y262C-L298C和L265C-A295C) 的Tm值提高了1-2℃，而其PET降解活性仅为PET2 WT的一半左右。至于突变体T64C-T86C，由于难以纯化，故而无法获得足够的蛋白样品进行表征。
基于以上突变结果，作者将Tm值提高或PET降解活性改善的单点突变体进行了整合。结果如Figure 3C所示，通过逐步引入整合突变体，最终得到了最优突变体R47C-G89C-F105R-E110K-S156P-G180A-T297P (PET2 7M)，其Tm值提高了6.7℃，PET降解活性相较于PET WT提高了2倍。
Figure 4 活性的温度依赖性和反应时间依赖性
03
突变体对温度和反应时间的依赖性
为了确定突变体最高PET降解活性的最适温度，作者测量了突变体对于无定形PET塑料的降解活性的温度依赖性。结果如Figure 4A所示，PET2 WT在60℃时拥有最高活性 (0.4min-1)，而最优突变体PET2 7M的最适温度为68℃，其活性相较于PET2 WT提高至2.7min-1 (PET2 7M 68℃时对应的活性是其60℃对应的2倍)。此外，即使在80°C下，PET2 7M仍可检测到活性，而PET2 WT和其他两个突变体 (分别为PET2 4M和PET2 5M，绿色和蓝色) 失去了活性。该结果表明PET2 7M中的R47C-G89C突变在很大程度上有助于PET2 7M突变体的热稳定性。
为了进一步评估突变体的PET降解活性对时间的依赖性，作者比较了PET2 WT和PET2 7M对PET的降解活性 (分别在60°C和68°C，孵育24小时)。在无定形PET降解过程中，PET2 7M产生的产物总量是PET2 WT产生的产物总量的四倍以上（Figure 4B）。此外，重要的是，PET2 7M在1到24小时内保持了几乎恒定的降解率，表明在最佳温度68°C下具有长期热稳定性 (Figure 4C)。
04
总结
作者基于宏基因组挖掘到的PET降解酶PET2 WT，利用表面电荷优化、骨架稳定、和额外二硫键引入等策略设计了一系列热稳定性和PET降解活性提高的突变体。其中，最优突变体PET2 7M的Tm值提高了6.7°C，PET降解活性提高了6.8倍。
供稿：李庆宾
编辑：张彤 徐娅 李晓萌
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