2021/05/31
废弃塑料对环境和人类健康的负面影响已众所周知。目前大多数使用的塑料不容易回收利用，因此产生了严重的环境问题。研究表明，塑料中的增塑剂很容易从塑料中释放到环境中，成为环境污染的重要来源。邻苯二甲酸酯（PAEs）是塑料中最常用的增塑剂，可以增加塑料的柔韧性，稳定性和内聚力。同时，PAEs是一类内分泌干扰物，具有生殖毒性，同时会造成脂质代谢异常，诱发儿童肥胖病，干扰免疫反应，引起神经心理疾病。但伴随塑料丢弃所造成的严重“白色污染”，PAEs大量逸散到环境中造成空气、水源和土壤等的污染。植物对PAEs具有富集作用，由此造成食物链中PAEs的污染。已有研究采用物理吸附或化学降解的方法处理PAEs，但要实现PAEs的有效降解并不容易，同时也容易产生二次污染物。微生物降解是处理PAEs污染的一种绿色方法，具有效率高、反应条件温和、无二次污染等优点，但也存在缺点。虽然有些微生物能有效降解PAEs，但其安全性仍有待考虑，限制了这些微生物在食品中的直接应用。因此，筛选生物安全且对PAEs具有良好降解性能的菌株具有重要意义。
2021年1月北京工商大学食品与健康学院孙宝国院士团队在国际知名期刊Environmental Pollution在线发表了题为“An efficient phthalate ester-degrading Bacillus subtilis: Degradation kinetics, metabolic pathway, and catalytic mechanism of the key enzyme”的研究文章。该研究成功自白酒酒曲中分离到一种认为生物安全（GRAS）的微生物枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJQ0005，具有高效水解PAEs类污染物的特性，对混合PAEs的降解效率达到212.4 mg/(L·h)，研究同时解析了该菌株的PAEs降解代谢途径，以及PAEs酯键水解酶的催化机制。本文通讯作者为李秀婷教授，第一作者为徐友强副教授。
枯草芽孢杆菌BJQ0005具有同时降解邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)和邻苯二甲酸二乙基邻苯二甲酸己酯(DEHP)的能力。使用全细胞生物催化反应，在混合PAEs的总混合浓度为5000 mg / L（每10 mL反应混合物50 mg）下，混合PAEs的前12 h降解速率达到212.4 mg /（L·h）。这是野生型细菌降解PAEs的记录。
图1 枯草芽孢杆菌BJQ0005对混合PAEs的降解效率
PAEs的生物降解代谢途径通常分为两个阶段。第一阶段主要通过β-氧化或酯键的直接水解将PAE转化为邻苯二甲酸，邻苯二甲酸可通过脱羧作用转化为苯甲酸。第二阶段是裂解苯环以用于随后的代谢反应。而BJQ0005降解PAEs的第一阶段显示了一个异常的脱羧步骤，分别将MBP或MEHP转化为苯甲酸丁酯或苯甲酸2-乙基己酯。
图 2（a）枯草芽孢杆菌BJQ0005邻苯二甲酸酯类物质降解的关键基因代谢途径和（b）已知邻苯二甲酸酯代谢途径总结
有研究发现，与PAEs侧链结构相连的酯键是毒性的来源，甚至PAEs的一个酯键的水解都会降低毒性。许多研究已经研究了酯键水解酶，这些水解酶是脂肪酶，酯酶，角质酶和邻苯二甲酸酯水解酶。根据酯键的水解特性，这些酶可以进一步分为三类（I，II和III）。I组酶可以水解PAEs的一个酯键；II组酶可以水解单酯邻苯二甲酸酯的酯键，III组酶可以催化PAEs的二酯键水解。从已经在基因组中注释基因中选了18个基因进行表达，并验证了这些蛋白质可水解PAEs和邻苯二甲酸单酯的酯键。其中GTW28_09400和GTW28_13725显示PAEs的单酯键水解，属于I组酶。GTW28_17760显示DBP和DEHP的二酯键水解，表明它是二酯键水解酶，属于III组酶。研究已经发现与I和II组酶的组合相比，III族酶对PAEs的酯键水解是有利的。
图3 邻苯二甲酸二酯和邻苯二甲酸单酯酯键水解酶
二酯键水解酶GTW28_17760具有水解5种共性邻苯二甲酸酯的能力，注释为酯酶，催化活性中心为Ser-His-Glu三联体，Glu的羧基使His极化，倾向于接收Ser羟基的质子，促使Ser羟基氧原子亲核攻击底物的羧基碳原子。但该酶水解邻苯二甲酸酯第二个酯键的效率明显低于第一个酯键，研究分析其机制在于水解邻苯二甲酸酯单酯键的中间产物具有羧基，与底物的催化活性中心His形成氢键，阻碍His与Ser的相互作用，弱化Ser亲核进攻底物的能力。这一催化机制的阐释有助于为理性设计或者定向进化改善酶的催化特性提供依据。
图4 GTW28_17760的同源模拟及与邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）和邻苯二甲酸单异丁酯（MIBP）的分子对接
感谢孙宝国老师和李秀婷老师课题组对本公众号的支持！
供稿：徐友强老师
审核：崔志勇 王招悬
编辑：李晓萌 张彤 徐娅
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