题目：蔗糖添加定向增加了对虾养殖系统细菌群落的趋同和共现网络的稳定性
第一作者：Haipeng Guo (郭海朋)
通讯作者：Haipeng Guo (郭海朋)、Deming Zhang (张德民)
通讯单位：宁波大学
影响因子：7.290
DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00288-x
背景
凡纳滨对虾是世界三大对虾养殖品种之一，但病害频发导致它的产量和质量都不稳定，成为制约对虾养殖业发展的瓶颈。生物絮团养殖技术（BFT）通过向养殖系统中添加碳源促进异养菌的大量繁殖从而改善水质并降低病害的发生。蔗糖已被报道是一种能够通过调控细菌群落为对虾创建更加稳定生长环境的有效碳源。但是，蔗糖添加对生物絮团养殖系统中细菌群落的相互作用、共现网络和组装机制仍不清楚。本研究系统分析了蔗糖添加维持的三个不同C/N比（CK、CN10和CN15）对虾养殖系统中三个生境（水体、絮团和肠道）的细菌群落的互作关系及构建机制，以期为对虾养殖系统微生物群落的定向调控提供理论基础。
结果分析
1.蔗糖添加增加了对虾养殖系统不同生境间细菌群落的相似性
蔗糖添加没有改变水体细菌群落的α-多样性，但显著增加了絮团和肠道细菌群落的Richness、Evenness和phylogenetic diversity指数，且显著降低了肠道细菌α-多样性指数的变异度。蔗糖添加显著改了养殖系统不同生境细菌群落的结构，三个生境的细菌群落结构随着蔗糖添加量增加沿PCoA1轴逐渐聚拢，表明添加蔗糖增加了养殖系统中水体、絮团和肠道细菌群落的相似性（图1A）。Bray-Curtis距离相似性分析表明蔗糖添加显著降低了水体到絮团、水体到肠道和絮团到肠道细菌群落的距离，进一步说明了蔗糖添加后水体、絮团和肠道细菌群落相似性增加（图1B）。此外，研究发现蔗糖添加后水体细菌群落离散度增加，而肠道细菌群落离散度显著降低（图1C），我们前期结果也发现水体细菌群落对碳源添加响应更加迅速且波动较大，而使肠道菌群变得更加稳定（Huang 等, Marine Life Science & Technology, 2022, Doi: 10.1007/s42995-021-00124-9），表明蔗糖添加后可能更有利于维护肠道菌群的稳定性，从而降低对虾病害的发生。
图1 蔗糖添加对对虾养殖系统中水体、絮团和肠道细菌群落结构的影响。（A）基于BC距离的PCoA分析；（B）三个生境中细菌群落相似性；（C）组内细菌群落相似性。CK：对照组；CN10：碳氮比为10组；CN15：碳氮比为15组。
在对照和蔗糖添加组，对虾养殖系统中水体和絮团细菌群落主要由α-变形菌纲、拟杆菌门、放线菌门、δ-变形菌纲、浮霉菌门和绿湾菌门组成，而在肠道中上面的δ-变形菌纲和绿弯菌门细菌主要由软壁菌门和γ-变形菌纲代替。蔗糖添加显著增加了三个生境中放线菌门的相对丰度，增加了肠道中α-变形菌纲、拟杆菌门等的相对丰度而降低了厚壁菌门和软壁菌门的丰度。蔗糖添加增加了三个生境共有OTUs的数量和组成（图2a），在对照组中，不同生境共有OTUs的优势类群显著不同，水体中主要为红杆菌科和黄杆菌科，絮团中为红杆菌科、黄杆菌科和Oligoflexaceae，而在肠道中主要为红杆菌科、弧菌科和支原体科；蔗糖添加下三个生境共有OTUs优势类群组成相似，主要由红杆菌科、微杆菌科、脱醌杆菌科和黄杆菌科组成（图2b），表明蔗糖添加可能重塑了对虾养殖系统细菌群落并且增加了水环境（水体和絮团）中的细菌向肠道迁移。溯源分析也表明在对照组肠道中只有5%和28.2%细菌分别来自于水体和的絮团，而在蔗糖添加组中有超过50%的肠道细菌可以从水环境中追溯到，尤其在CN15组中，肠道中分别有41.7%和52.5%可以从水体和絮团中溯源（图2c），这进一步说明了蔗糖添加增加了水环境细菌向肠道中迁移。我们进一步把对虾养殖系统中OTUs分为核心类群（三个养殖系统中都存在的OTUs）、单个养殖系统特有的类群（三个养殖系统特异性存在的OTUs）和单个生境中特有的类群（不同养殖系统不同生境中特有的OTUs），结果表明对虾养殖系统共有258个核心OTUs，它们的相对丰度在每个样品中都超过了50%。此外，肠道中核心OTUs的相对丰度显著高于水体和絮团，蔗糖添加增加了特有OTUs的数量，但是它们的相对丰度和对照组没有显著差异，表明大多数的蔗糖添加特有的OTUs为稀有类群（图2d）。
图2 不同养殖系统中不同生境共有OTUs的数量（a）、类群组成及丰度（b）、溯源分析（c）和核心及特有OTUs的数量和丰度（d）。CK：对照组；CN10：碳氮比为10组；CN15：碳氮比为15组。
2.蔗糖添加对对虾养殖系统中细菌群落核心和特有差异类群的影响
在水体和絮团中，蔗糖添加对特有差异类群数量和丰度的影响大于核心类群，但是蔗糖添加对肠道核心类群的影响更大（图3a）。蔗糖添加主要诱导了水环境中核心OTUs的积累，但是显著降低了特有OTUs的丰度（尤其是组特有的OTUs），在水体和絮团中分别降低了30.2-39.9%和26.5-30.3%（图3b）。值得注意的是，蔗糖添加主要改变了肠道中核心OTUs的丰度（图3b和c）。尽管不同生境OTUs对蔗糖添加的响应模式不同，但与对照组相比，显著富集的OTUs类群组成是相似的，主要由脱醌杆菌科、微杆菌科、丙酸杆菌科、红杆菌科、黄杆菌科和浮霉菌科组成。而对于显著下降的OTUs类群组成在不同生境中不同，如水体中主要为放线菌门、红杆菌科和支原体科，絮团中为放线菌门、红杆菌科、δ-变形菌纲和浮霉菌门，而在肠道中主要为红杆菌科、发光杆菌、弧菌和支原体（图3c）。蔗糖添加显著降低的特有类群主要为红杆菌科、黄杆菌科和δ-变形菌纲等（图3c）。
图3 对照和蔗糖添加对虾养殖系统不同生境中差异OTUs的数量（a）和丰度变化（b）。CK：对照组；CN10：碳氮比为10组；CN15：碳氮比为15组。
3.蔗糖添加增加了对虾养殖系统细菌群落的共现网络稳定性
对虾不同养殖系统细菌共现网络分析结果表明，蔗糖添加没有显著改变整体群落共现网络节点的正相关和负相关比例，但是极大的改变了核心和特有节点之间的相互作用。蔗糖添加降低了核心节点的正相关比例，但是增加了核心节点和特有节点之间及特有节点之间正相关比例，表明蔗糖添加可能通过核心类群招募特异类群。我们用三个参数（模块度、Cohesion值和鲁棒性）来表征养殖系统细菌群落共现网络的稳定性。结果表明，蔗糖添加增加了养殖系统细菌群落的模块度、整体类群和核心类群|负/正cohesion |比值（图4a）和核心节点的自然连通度（图4b），表明了核心节点在维护养殖系统稳定性中发挥着重要作用，而蔗糖添加进一步增加了核心节点在维护细菌网络稳定性中的作用。
图4 不同养殖系统细菌群落共现网络Coheison值（a）和鲁棒性（b）。CK：对照组；CN10：碳氮比为10组；CN15：碳氮比为15组。
4.核心类群在维护养殖系统稳定性和促进对虾生长中发挥更重要的作用
通过计算网络节点的Zi和Pi值筛选三个养殖系统细菌网络中的关键类群。结果表明，三个养殖系统细菌网络中大多数节点为peripherals，没有发现节点为network hubs，在CK、CN10和CN15养殖系统网络中分别筛选到2、4和2节点为 module hubs, 和5、5和13 节点为connectors（图5a）。在CK养殖系统中，关键类群的相对丰度普遍都小于0.5%，但是在CN10和CN15系统中的关键类群的相对丰度显著增加（图5b）。三个养殖系统中module hubs类群都是核心类群，在CK和CN10中各有一个connectors为特有类群，CN15中有5个为特有类群（图5b）。在CK中，关键类群主要与属于α-变形菌纲和浮霉菌门的核心类群正相关，而与特有类群呈负相关关系。然而在蔗糖添加养殖系统中，关键类群与属于α-变形菌纲和β-变形菌纲的核心类群和属于拟杆菌门和绿湾菌门的特有类群负相关（图5c）。蔗糖添加下关键类群积极招募了属于放线菌门的核心或特有类群（图5c），表明蔗糖添加可以定向的招募放线菌门细菌，而这些细菌与对虾生长参数显著正相关（图5d）。
图5 细菌共现网络中关键类群的鉴定及其与水质和对虾生长参数的相关性。（a）对照和蔗糖添加养殖系统细菌群落共现网络中关键类群及其相对丰度；（b）关键类群与其招募的细菌类群；（c）关键核心类群与对虾系统水质和对虾生长参数的相关性。CK：对照组；CN10：碳氮比为10组；CN15：碳氮比为15组。
5.蔗糖添加定向促进了水环境细菌群落向肠道的迁移
进一步比较分析了蔗糖添加下水环境细菌群落对肠道细菌群落构建的影响。结果发现，在CK组养殖系统中，水体到肠道和絮团到肠道的细菌群落构建主要以随机性为主，然而蔗糖添加后这些过程主要以确定性选择为主（图6），表明蔗糖添加可以定向的塑造对虾肠道细菌群落的组装。通过对核心和特有类群构建过程的研究发现，蔗糖添加主要影响了水环境特有类群到肠道的确定性过程，表明蔗糖添加可以定向招募特有细菌类群在对虾肠道中富集。
图6 不同养殖系统中细菌群落从水体和絮团到肠道的构建过程。（a）βNTI值；（b）确定过程和随机过程对细菌群落构建的贡献度。CK：对照组；CN10：碳氮比为10组；CN15：碳氮比为15组。
结论
蔗糖添加后三个生境（水体、絮团和肠道）细菌群落结构和组分变得更加相似；在蔗糖添加组肠道细菌群落主要来自于水体和絮团，但是在对照组中只有少部分细菌群落可以从水体和絮团中迁移到肠道中；蔗糖添加同时增加了三个生境中核心细菌类群的丰度，这些核心类群属于放线菌门、红杆菌科和黄杆菌科；这些富集的核心细菌类群在维护细菌网络的稳定性方面发挥着重要的作用，并且很多核心类群可以作为关键微生物促进对虾的生长。此外，添加蔗糖后细菌群落从水体和絮团到肠道的构建过程以确定性为主，表明蔗糖添加可以定向的塑造对虾养殖系统细菌群落的组装。以上结果为通过选择性的调控对虾养殖系统某些促进对虾生长的细菌类群提供了科学基础。
宁波大学张德民/郭海朋对虾养殖微生态组是国内外最早聚焦于对虾养殖系统微生物群落的演替及构建过程的研究团队之一。近几年，该小组深入研究了外源碳源输入对对虾养殖系统微生物群落调控的影响，阐明了葡萄糖输入对凡纳滨对虾肠道微生物的影响及其调控机制（Huang 等, Marine Life Science & Technology, 2022, Doi: 10.1007/s42995-021-00124-9）；揭示了生物絮团不同粒级微生物群落差异及其对对虾肠道微生物的塑造作用（Huang等，Aquaculture, 2020, 523: 735159）；揭示了蔗糖输入下对虾肠道微生物和活性代谢产物的互作关系（Guo等, Frontiers in Microbiology, 2020, 11: 652）；解析了蔗糖输入对水体微生物群落结构和组成的影响及其与水质参数的相关性（Zhu等，Aquaculture Research, 2021, 52: 4184-4197），这些结果为发展对虾微生态干预技术及微生物制剂的定向开发提供了扎实的理论基础。
1.Haipeng Guo*, Pengsheng Dong, Fan Gao, et al. Sucrose addition directionally enhances bacterial community convergence and network stability of the shrimp culture system. npj Biofilms Microbiomes, 2022, 8: 22. https://doi.org/10.1038/s 41522-022-00288-x
2.Lei Huang, Haipeng Guo*, Zidan Liu, et al. Contrasting patterns of bacterial communities in rearing water and gut of Litopenaeus vannamei in response to exogenous glucose addition. Marine Life Science & Technology, 2022, Doi: 10.1007/s42995-021-00124-9.
3.Yueyue Zhu, Sipeng Wang, Lei Huang, et al. Effects of sucrose addition on water quality and bacterioplankton community in the Pacific White Shrimp (Litopenaeus vannamei) culture system. Aquaculture Research, 2021, 52: 4184-4197.
4.Haipeng Guo*, Lei Huang, Songtao Hu, et al. Effects of carbon/nitrogen ratio on growth, intestinal microbiota and metabolome of shrimp (Litopenaeus vannamei). Frontiers in Microbiology, 2020, 11: 652.
5.Lei Huang, Haipeng Guo*, Chen Chen, et al. The bacteria from large-sized bioflocs are more associated with the shrimp gut microbiota in culture system. Aquaculture, 2020, 523: 735159.
第一作者简介
第一作者：郭海朋，博士，宁波大学海洋学院教师，2017年12月毕业于浙江大学，获理学博士学位，2018年1月至宁波大学海洋学院工作。2015年12月至2017年10月获国家留学基金委资助至加拿大Lakehead University（湖首大学）生物工程系学习。主要从事对虾肠道微生物生态和微生物资源的开发利用等研究。主持国家自然科学青年基金等项目5项。在Bioresource Technology, npj Biofilms and Microbiomes，Biotechnology for Biofuels, Renewable Energy, Microbioal Biotechnology, Frontiers in Microbiology, Aquaculture等国际主流SCI刊物上发表学术论文40余篇；授权发明专利3项，其中1项转让到企业。
通讯作者简介
通讯作者：张德民，博士，宁波大学海洋学院二级教授。“863”项目首席专家、农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室“微生物与水域生态健康”团队负责人、中国微生物生态学副主任等。主要从事对虾养殖系统微生物组及其调控技术。主持完成国家863项目、国家自然基金面上项目等10余项，在Microbiome，npj Biofilms and Microbiomes, Molecular Ecology, Environmental Microbiology, Applied and Environmental Microbiology, Aquaculture等杂志上发表SCI收录论文70余篇，授权国家发明专利10余项。
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