全肠内营养对儿童克罗恩病肠道微生物群和胆汁酸代谢的影响
The impact of exclusive enteral nutrition on the gut microbiome and bile acid metabolism in pediatric Crohn's disease
Research article，2022年11月30日，Clinical Nutrition，7.64/Q1区
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.clnu.2022.11.018
第一作者：吕垚
通讯作者：倪艳，陈洁
通讯单位：浙江大学医学院附属儿童医院
- 前言 -
克罗恩病(Crohn’s disease, CD)是一种慢性炎症性疾病，累及整个胃肠道，可引起肠外表现，免疫反应受损。CD在世界各地的成人和儿童中的患病率都在增加。全肠内营养治疗(EEN)是诱导轻度至中度小儿CD缓解的一线治疗方法。EEN作为一种由聚合物或元素配方组成的完全流质饮食，常规给予小儿CD患者6-12周，除水外不加任何其他饮食。EEN治疗的CD缓解率约为90%。然而EEN在CD中减轻炎症和诱导粘膜愈合的机制仍不完全清楚。
- 摘要 -
本文旨在探究EEN对CD患儿肠道微生物组(GM)和胆汁酸（BAs）代谢的影响，在粪便中进行靶向代谢组学分析和宏基因组学分析，研究CD患者在EEN治疗2个月前后BA和GM的变化。采用小儿克罗恩病活性指数(PCDAI)和粪便钙卫蛋白(calprotectin)评价CD的严重程度和黏膜炎症。研究发现患者GM结构和次级胆汁酸代谢均明显受损，经EEN治疗后可部分恢复正常水平。其中厚壁菌门(Firmicutes)和11个BAs与PCDAI评分和粪便钙卫蛋白密切相关。同时，厚壁菌与BAs之间的密切相互作用可能有助于EEN治疗后CD的缓解。qPCR数据进一步证实，EEN处理后厚壁菌门、黄曲霉属(Flavonifractor)和梭状芽孢杆菌(Clostridium V)的相对表达量有所提高。
- 结果 -
本研究共招募了27名新发的小儿CD患者和27名健康对照组（图1），研究发现CD与HC的微生物群落结构在门,属水平上存在显著差异(图2A-B)。经EEN治疗后，被破坏的肠道微生物群落平衡得到恢复(图2C-D)。
图1:CD患儿和健康对照组的研究概况。
图2：CD患儿在EEN治疗前后和健康对照组的GM差异。
1. EEN改善了CD患者原发性和继发性BA代谢失衡
分析CD患者EEN诱导前后粪便BAs谱，并与健康对照进行比较，发现三组BAs组成不同(图3A)。在HC组中，次级非共轭BAs占主导地位。然而，BA在CD患者中有明显的变化，主要由原发性和继发性非共轭BA组成。在EEN治疗后，次级未结合BAs水平向健康对照组水平上升(图3B)。PLS-DA也表明，活动性或缓解期CD患者在EEN治疗前后BAs的代谢谱不同(图3C)。其中，在EEN诱导治疗后CD缓解患者中，石胆酸(LCA)、熊胆酸(UCA)、3β-胆酸(βCA)等次生胆汁酸浓度均显著升高（图3D)。
图3: 三组间BAs的变化。
2. 厚壁菌门最丰富的群与
PCDAI评分和钙卫蛋白密切相关
采用Spearman相关法评价细菌分类类群丰度与PCDAI和calprotectin的相关性。PCDAI评分和calprotectin与Proteobacteria、Mucoromycota和Basidionycota类群呈正相关，与Firmicutes、Euryarchaeota、Thermotogae等10个门呈负相关(图4A-B)。在属水平上的差异细菌与PCDAI和calprotectin的相关性网络分析(p<0.01)表明，有300多个差异微生物类群属于厚壁菌门(图4C-F)。
图4：厚壁菌门与PCDAI评分及钙卫蛋白的相关性分析。
3. BA谱改变与PCDAI评分及钙卫蛋白密切相关
为了进一步评估BAs谱改变是否与CD疾病状态和结肠炎症相关，将BAs谱与PCDAI评分和钙卫蛋白做了相关性分析。12个BAs , isoLCA、HDCA、LCA、βCDCA、NorCA、ωMCA、βUCA、dehydroLCA、βUDCA、6-ketoLCA、βCA、UCA与PCDAI评分及钙卫蛋白呈负相关。其中11个BAs(即isoLCA、HDCA、LCA、βCDCA、NorCA、ωMCA、βUCA、dehydroLCA、βUDCA、βCA、UCA)在缓解后也有明显变化（图5A-B）。
图5：BAs浓度与PCDAI评分和钙卫蛋白的关系。
4. CD患者不同BA谱与肠道微生物特征
在EEN治疗反应中的相关性
根据上述结果可以发现EEN治疗的潜在机制分别与BAs谱和GM结构相关。因此，假设厚壁菌门最丰富的类群(图4)与11个相关度最高的BAs isoLCA、HDCA、LCA、βCDCA、NorCA、ωMCA、βUCA、dehydroLCA、βUDCA、βCA和UCA(图6A)之间存在一定的关系。如图6A-B所示，BA isoLCA、HDCA、LCA、βCDCA、NorCA、ωMCA、βUCA、dehydroLCA、βUDCA、βCA、UCA在门水平上与厚壁菌门类群呈正相关。然后分别在门、纲、目、科、属、种水平上探讨了相关性最高的9个BAs isoLCA、HDCA、LCA、βCDCA、ωMCA、βUCA、dehydroLCA、βUDCA、UCA与厚壁菌门的关系。
图6: isoLCA、HDCA、LCA、βCDCA、NorCA、ωMCA、βUCA、dehydroLCA、βUDCA、βCA、UCA浓度与厚壁菌门的相关性分析。
5. 各组间厚壁菌门、梭状芽孢杆菌和黄曲霉菌
相对表达量发生变化
为进一步强化该结论，采用RT-qPCR比较了所选的Firmicutes、Clostridium V和Flavonifractor的相对表达量。CD患者中Clostridium V和Flavonifractor的表达明显降低，经PCR检测，EEN诱导治疗后，Firmicute、Clostridium V和Flavonifractor的表达提高，这与宏基因组测序数据一致（图7A-C）。
图7: 各组间厚壁菌、梭状芽孢杆菌V和黄曲霉菌的相对表达量。
- 总结 -
通过PCDAI评分和粪便钙卫蛋白检测显示，厚壁菌门和肠道中一级和二级BAs成分的平衡与CD疾病的健康状况密切相关。了解肠道微生物群和BAs代谢的恢复过程将有助于我们探索EEN治疗的潜在机制。
参考文献
Lv, Y., Lou, Y., Liu, A. et al. The impact of exclusive enteral nutrition on the gut microbiome and bile acid metabolism in pediatric Crohn's disease. Clinical Nutrition 42, 116-128 (2022). https://doi.org/10.1016/j.clnu.2022.11.018
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