为进一步提高《微生物组实验手册》稿件质量，本项目新增大众评审环节。文章在通过同行评审后，采用公众号推送方式分享全文，任何人均可在线提交修改意见。公众号格式显示略有问题，建议电脑端点击文末阅读原文下载PDF审稿。在线文档(https://kdocs.cn/l/cL8RRqHIL)大众评审页面登记姓名、单位和行号索引的修改建议。修改意见的征集截止时间为推文发布后的72小时，文章将会结合有建设性的修改意见进一步修改后获得DOI在线发表，同时根据贡献程度列为审稿人或致谢。感谢广大同行提出宝贵意见。
EGFP荧光标记大肠杆菌的构建
Construction of EGFP Fluorescent-labeled E. coli strain
张一帆1, 2, #，徐俊1, 2, 3, #，刘玉兰1, 2, *
1北京大学人民医院消化内科，北京；2北京大学人民医院免疫介导消化疾病临床研究中心，北京；3北京大学人民医院中心实验室，北京
#共同第一作者
*通讯作者邮箱: liuyulan@pkuph.edu.cn
摘要：扩增子和宏基因组测序等方法为筛选临床疾病特异的致病菌 (属、株) 提供了便利，而进一步对已筛选的致病菌进行致病机制的研究也尤其重要。与原位杂交检测致病菌相比，通过荧光对菌株直接进行标记的方法可更灵敏、快速及精确地对菌株进行示踪，该方法可应用于相关动物和细胞模型中单菌定植、移位等致病机制研究。本方案将以E. coli MG1655为例，介绍如何利用EGFP对E. coli菌株进行标记示踪。
关键词：EGFP，大肠杆菌，小鼠，细菌移位
材料与试剂
1.超白玻璃盖玻片 （江苏世泰实验器材有限公司，catalog number: 80340）
2.粘附载玻片 （江苏世泰实验器材有限公司，catalog number: 80312-3161）
3.50 ml离心管 （美国康宁corning离心管，catalog number:430828）
4.2.0 ml的离心管 （美国康宁corning离心管，catalog number:430659）
5.E. coli MG1655 （中国典型培养物保藏中心）
6.CV129质粒 （EcoRI/XhoI酶切）（上海吉凯基因化学技术有限公司）
7.C57BL/6J小鼠 （北京维通利华实验动物技术有限公司）
8.无菌（无抗生素）LB液体培养基 （北京索莱宝科技有限公司，catalog number: T1010）
9.无菌（含氨苄青霉素）LB液体培养基 （自制，T1010加5 g氨苄青霉素粉末）
10.TIANSeq HiFi Taq酶 （天根生化科技（北京）有限公司，catalog number: NG219）
11.琼脂糖 （西班牙Biowest Agarose，北京索莱宝科技有限公司，catalog number: YZQZT）
12.TAE电泳缓冲液粉末 （北京索莱宝科技有限公司，catalog number: T1061）
13.琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 （天根生化科技（北京）有限公司，catalog number: S7920）
14.无内毒素质粒中量提取试剂盒 （离心柱型） （天根生化科技（北京）有限公司，catalog number: S8031）
15.普通DNA产物纯化试剂盒 （离心柱型） （天根生化科技（北京）有限公司，catalog number: M2016M2016）
16.去离子水 （18.2 MΩ·cm，由Milli-Q Gradient System制取）
17.OCT冰冻切片包埋剂 （SAKURA美国，catalog number: 4583-118ML）
18.丙酮 （国药集团化学试剂北京有限公司，catalog number: A10000494）
19.Triton X-100 （北京索莱宝科技有限公司，catalog number: T8200）
20.封闭山羊血清 （北京索莱宝科技有限公司，catalog number: SL038）
21.荧光封片剂 (含DAPI) （北京中杉金桥生物技术有限公司，catalog number: ZLI-9557）
22.PBS缓冲液 (pH 7.2-7.4) （北京索莱宝科技有限公司，catalog number: P1020）
23.LB营养琼脂琼平板 (含氨苄青霉素) (北京索莱宝科技有限公司，catalog number: L2010)
24.BamH1（日本Takara公司，catalog number: 1010S）
25.Xho1内切酶（日本Takara公司，catalog number: 1094S）
26.3M 乙酸钠 （pH5.2）（北京索莱宝科技有限公司，catalog number: A1070-100ml）
27.SOC液体培养基（干粉）（北京索莱宝科技有限公司，catalog number: L1020-1L）
28.BTX 电极杯（北京沫之东生物技术有限公司，catalog number: YQ1633119185）
29.1.5 ml Eppendorf管（美国Axygen公司，catalog number: 24918079）
仪器设备
1.电泳仪 （美国Bio-Rad公司，美国）
2.电转仪 （美国Bio-Rad公司，美国）
3.恒温培养箱 （美国Thermo Scientific公司）
4.恒温细菌培养箱 （日本三洋公司）
5.台式低温高速离心机 （德国Eppendorf公司）
6.超低温冰箱 （青岛海尔股份有限公司）
7.尼康共聚焦显微镜 （日本尼康公司，型号AR1）
8.冰冻切片机 （德国徕卡公司，型号CM3050s）
9.凝胶成像仪 （上海Tanon 1600）
实验步骤
一、构建E. coli EGFP-MG1655荧光标记大肠杆菌[1]
1.使用TIANSeq HiFi Taq酶扩增目的基因EGFP片段 (引物序列见表1)。
表1. EGFP基因扩增引物序列
Forward primer (5’-3’)
GCGTGGATCCCCAGGAATTCCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC
Reverse primer (5’-3’)
TCACGATGCGGCCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG
1.1反应体系：
试剂
体积 (μl)
Taq酶
10
Forward primer
1
Reverse primer
1
人基因组DNA
1
H2O
7
注：人基因组DNA来源于人肝癌细胞系HepG细胞提取DNA。
1.2反应条件：
反应步骤
温度 (°C)
时间
预变性
94
5分钟
变性
94
30秒
退火
65
30秒
延伸
72
1分钟
充分延伸
72
10分钟
保存温度
12
该步骤进行35个循环。
1.3琼脂糖凝胶电泳：180 mA，10分钟。
1.4凝胶成像仪显影成像。
1.5将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，向胶块中加入等倍体积溶液PN，漂洗后过吸附柱，切胶纯化回收EGFP目的片段。
2.CV129-EGFP载体的构建
2.1利用BamH1和Xho1内切酶酶切CV129载体。
酶切体系：
试剂
体积 (μl)
BamH1
1
Xhol1
1
Buffer2.1
2
CV129 vector
2 μg
Water
to 20
2.237 °C孵育5小时，鉴定成功后凝胶回收 （鉴定引物见表2）。
表2. 鉴定引物序列
Forward primer (5’-3’)
GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG
Reverse primer (5’-3’)
CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG
2.3连接：
试剂
体积 (μl)
EGFP基因组DNA
300 ng
CV129载体
1
Ligase buffer
2
T4 ligase
1
Water
10
16 °C孵育过夜。
注：EGFP基因组DNA使用Nanodrop测量DNA浓度，根据质量=体积*浓度公式计算。
3.E. coli MG1655感受态细胞的制备
3.1将E. coli MG1655菌液在37℃摇床上培养至OD600＝0.6，随后置于50 ml预冷的离心管中，加入ddH2O，4 °C，2,500 rpm离心10分钟。
3.2弃上清，离心管中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，重悬，4 °C，4,000 rpm离心10分钟，重复该步骤一次。
3.3弃上清，加入少量灭菌预冷的10%甘油重悬菌体，再加满10%甘油，4 °C，4,000 rpm离心10分钟。
3.4弃上清，每个离心管中加入5 ml 10%的甘油，使沉淀悬浮后获得E. coli MG1655感受态细胞。
4.将重组质粒CV129-EGFP电转至E. coli MG1655大肠杆菌
4.1将构建的CV129-EGFP载体转移至1.5 ml Eppendorf管中，加入下列试剂：
试剂
体积 (μl)
ddH2O
10
3 M NaAC （pH 5.2）
2
无水乙醇
50
T4 ligase
1
Water
10
轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20°C放置1小时以上。
4.24 °C，12,000 rpm离心30分钟。
4.3小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物。
4.4加入500 μl 70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀。注：不要离心混匀。
4.54 °C，12,000 rpm离心30分钟。
4.6小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味。
4.7加入10 μl ddH2O重新溶解沉淀。
4.8从-80 °C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。
4.9取1 μl纯化后的质粒于1.5 ml的离心管中，将其和0.1 cm的电极杯一起置于冰上预冷。
4.10将100 μl解冻的E. coli MG1655感受态细胞转移至此1.5 ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10分钟。
4.11打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1 KV。
4.12将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部。
4.13将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1,000 μl的SOC液体培养基，重悬细胞后转移到1.5 ml的离心管中。
4.1437 °C，220~250 rpm复苏1小时。
4.15取20 μl转化产物加160 μl SOC液体涂板，放于37 °C恒温细菌培养箱过夜培养。
5.挑取单克隆进行PCR凝胶电泳检测和鉴定
5.1反应体系：
试剂
体积 (μl)
Taq酶
10
Forward primer
1
Reverse primer
1
基因组DNA
1
H2O
7
5.2反应条件：
反应步骤
温度 (°C)
时间
预变性
94
3分钟
变性
94
30秒
退火
55
30秒
延伸
72
30秒
充分延伸
72
5分钟
保存温度
12
-
该步骤进行35个循环。
5.3琼脂糖凝胶电泳：180 mA，10分钟。
5.4凝胶成像仪显影成像。
二、利用E. coli EGFP-MG1655在野生型C57BL/6J小鼠中示踪细菌[2]
细菌标记技术是使用标记物标记细菌，以实现对目标细菌的识别，从而对其进行定位和示踪。为了探究E. coli EGFP-E. coli MG1655是否在小鼠的肠道黏膜上进行定位，本实验采用肝脏冰冻病理切片观察，对细菌粘附的现象进行检测。为了定位E. coli MG1655，构建了增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）荧光标记和氨苄青霉素抗性的E. coli EGFP-MG1655，并将其应用于动物实验。
1.将C57BL/6J小鼠 （饲养于SPF环境，北京维通利华实验动物技术有限公司）分别给予正常饲料饮食 （Normal diet, ND）喂养至8周龄。
2.将200 μl LB培养基和200ul含1 × 108 cfu）E. coli EGFP-MG1655菌液（分别灌胃C57BL/6J小鼠，小鼠自由活动1小时。
3.随后牺牲小鼠后，截取小鼠0.5-1.0 cm肠道组织，剪取一次性胶头滴管圆形头部1.5 cm，加入OCT化合物，将肠道垂直管底放入，调整肠道组织至平展状态，液氮瞬时冷冻，将肠道包埋在OCT化合物中。
4.于冰冻切片机将OCT包埋的组织样本切片，厚度为7 μm，将组织标本吸附在粘附载玻片上。
5.切片置于-20 °C预冷丙酮中固定。
6.将切片用PBS清洗3分钟，2次。
7.将切片用0.1% Triton固定破膜3分钟，PBS清洗3分钟，2次。
8.将切片用PBS加1%的羊血清封闭30分钟。
9.将切片用PBS清洗3分钟，2次。
10.将切片用DAPI染色，0.16 mm~0.19 mm盖玻片封片。
11.尼康共聚焦显微镜拍照。
结果与分析
使用CV129载体可将EGFP荧光标记基因和氨苄青霉素抗性基因导入E. coli MG1655 (图1A)，琼脂糖电泳示EGFP标记的且具有氨苄青霉素抗性的E. coli EGFP-MG1655构建成功 (图1B)，含氨苄青霉素的LB培养基可见E. coli EGFP-MG1655细菌菌落生长 (图1C)，下一步该菌可应用于动物实验。
图 1. E. coli EGFP-MG1655荧光标记菌株构建
A. EGFP重组质粒的构建和转化过程 (上海吉凯基因公司供图)；B. E. coli EGFP-MG1655的PCR鉴定；C. E. coli MG1655和E. coli EGFP-MG1655涂板鉴定。
用E. coli EGFP-MG1655灌胃处理C57BL/6J小鼠，小鼠肠道冰冻病理切片均可见明显的绿色荧光信号，可对E. coli EGFP- MG1655在肠道的粘附进行示踪 (图2)。
图2. E. coli EGFP- MG1655可粘附至C57BL/6J小鼠肠道
小鼠肠道冰冻切片中E. coli EGFP-MG1655的检测，可定位于肠道细胞周围 （红色箭头，EGFP绿色荧光信号），白色刻度线表示20 µm。
失败经验
1.在小鼠取材过程中要保证无菌操作，器械要高压灭菌，实验组和对照组要分别准备两套器械，以免产生细菌污染。
2.小鼠的肠道组织取材后用PBS冲洗，以免制备病理切片拍照时产生背景荧光。
3.OCT固定小鼠组织标本时使用液氮渐冻标本。
致谢
本文实验方案所用仪器由北京大学人民医院消化内科实验室和北京大学医学部药学院国家重点实验室提供。资金来源：国家自然科学基金 (81873549) 和北大医学交叉研究种子基金 (BMU2020MX011)。
