常记溪亭日暮，沉醉不知归路。
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前言
每种细胞的培养方法不同。
HEK293细胞是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，是加拿大McMaster University的F.L.Graham与J.S.Miley于1976年用DNA转染技术构建而成。
Human（人类） embryonic（胚胎） kidney（肾脏） cells，即是HEK细胞。
5型腺病毒：Adenovirus 5，Ad5。
293细胞表达转染的腺病毒5的基因，允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖,是最常用于包装及扩增腺病毒载体的工具细胞。
邱丹兰.浅谈HEK293细胞各细胞系的特点[C].广西药学会2015年学术年会论文集.2015:262-263.
01 原代细胞培养
这里的原代，我估计是厂家传代后刚刚卖给我们的意思。
不知道！
02 细胞复苏
细胞复苏流程：
1.取细胞：从液氮罐拿出细胞，37度暖宝宝快速解冻。
2.裂开细胞（消化细胞）：把细胞吸出来（不能用嘴巴吸
3.中和裂解液：加入2~3倍体积的营养液（比如之前胰酶用了1毫升，现在就加2~3毫升），中和trypsin。然后，将他们转移到50毫升离心管。
营养液为含20%FBS的DMEN培养基。
FBS：Fetal Bovine Serum，胎牛血清。
DMEM是 dulbecco's modified（改良） eagle（老鹰） medium（基质）的缩写，DMEM培养基是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。
4.离心：800转左右，离心3~5分钟，吸走上清液并丢弃。也可以不离心，根据细胞的特点操作。
5.转移：加入含10~20%FBS的DMEN营养液，稀释沉淀，轻轻地吹沉淀，尽量吹得很均匀，让细胞分布在营养液中，然后转移到培养罐罐。
6.复苏：按照培养罐罐的大小（75号的15~30毫升），加入相应体积的培养基，轻轻地水平摇啊摇几次，放入37度温箱。搞定。
最后一步，培养基为含10~20%FBS的DMEN营养液，并且还要加入双抗，浓度还像是1%。
双抗：阿司匹林+氯吡格雷，治疗心脏病。
双抗：青霉素+链霉素，防止杂菌生长。
03 细胞传代
假如第一次培养的细胞是1代，把他们分成2瓶，生长出来的细胞就是2代子孙，不是，是二代儿子。
细胞传代流程：
1.判断死活：把培养小罐拿出来，显微镜偷窥，细胞死了就可以下班了。
这种圆形的细胞，一般就是死球了；张牙舞爪的才是活的。
2.丢弃原配：吸走原来的培养基（没有营养了，只有代谢废物，就是细胞的尿液和屁）。
3.PBS洗地：冲洗2次左右，把原来培养基的残余势力给全部清除，另外，培养基会降低胰酶的功力。
Phosphate磷酸盐 buffer缓冲 solution溶液，就是PBS。
4.裂开：0.05%trypsin大约1ml，裂开细胞，棒打鸳鸯，让抱团取暖的、躺平粘在瓶底的细胞离别成单个光棍细胞。37度温箱，2~5分钟左右。然后吹打细胞，让他们彻底成为一盘散沙（也可以用偷窥）。
下图是正在生长的张牙舞爪的细胞。
如何判断细胞有没有消化好（裂开），就是张牙舞爪的细胞变得又圆又亮，如下图。
5.终止分裂：尽快加入培养基，终止trypsin的七伤拳。培养基的量：trypsin的2倍左右。
6.离心机（可选）：必要时，或者闲着没事干，800转左右，离心3~5分钟，吸走上清液，彻底清除胰酶的七伤拳。
7.三国演义：把细胞平均分成3份左右，分装在新的培养瓶。按照瓶子大小（T25号4~5ml），加入培养基（10~20%FBS+双抗）。
8.培养：摇匀（然后显微镜偷窥）。放入温箱（37度，5%CO2），让他们自生自灭。
04 细胞铺板
细胞铺板流程：
1.裂开细胞：PBS清洗两三次，加入胰酶1mL裂开细胞大约2分钟，加入培养基终止胰酶的七伤拳，离心细胞。方法同上。
2.测细胞浓度：再次加入FBS约3mI，轻轻地，吹打液体，让细胞均匀的分布在溶液中，测细胞浓度！
一种方法是肉眼数细胞，一种方法是把20ul细胞液体打入玻璃板，让机器数细胞（这个机器要3辆宝马车的钱）
3.铺板浓度：每个培养孔的细胞浓度都要相同，铺板浓度为2～8×10的4次方／mL。
比如，测量下来，细胞浓度为100×10的4次方／mL。设定所有孔的浓度为5×10的4次方／mL，那么稀释20倍就可以啦。
假如每个孔放1毫升营养液，就是1000微升，那么，加入950微升营养液+50微升之前的细胞液体。
4.收工：按照培养小罐的体积加入培养基，把培养基摇匀，放入37度冰箱，里面的CO2好像是5%左右。
05 转染病毒
细胞铺板大约8小时后，开始转染病毒。
Polybrene闪亮登场。
polybrene，聚凝胺，这个鬼东西容易把病毒凝聚在细胞里面（其原理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用），又名为溴化己二甲铵（hexadimethrine bromide），是一种阳离子聚合物。提高慢病毒或腺病毒对细胞的感染效率。
Polybrene：是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒或腺病毒对细胞的感染效率。通常能提高感染效率 2~10 倍。
推荐工作浓度：10ug/ml，一般情况下，使用时，要把厂家的样本稀释1000~2000倍（好像是）。
1.配制培养基：DMEN培养基+FBS（胎牛血清）+Polybrene+双抗生素，让FBS的浓度为10~20%，Polybrene在原来的基础上稀释2000倍。
2.分装培养基：按照培养小罐罐的要求，每个孔加入相应体积的培养基。
3.加入病毒：加入要转染的慢病毒，稀释2倍。第一个孔稀释2倍，第二个孔在第一孔的基础上稀释10倍（假如每个孔50微升，从第一个孔吸5微升加入第二孔，加45微升营养液，就是稀释10倍了），第三孔稀释100倍，一直到第五个孔稀释1万倍。
以后要区分浓度，看免疫荧光就很明显。
4.门诊随访。
24小时后，PBS洗出含病毒的培养基（用吸管吸入离心管，放入专门的黄色垃圾袋处理，千万不能用嘴巴吸，会挂掉
48小时后，拍照，看看免疫荧光情况。
72小时后，拍照，看看免疫荧光情况。换入新的培养基。培养基有时候48小时就要换，等到72小时细胞会撕掉。
培养基颜色变黄，提示营养液快要枯竭了。
06 Polybrene说明书
网上复制来的使用说明：
1.推荐工作浓度：
Polybrene最佳终浓度因不同细胞株而异，通常范围在2~10μg/ml，最常用的浓度为5~8μg/ml。可以通过查阅相关文献或者预实验来摸索。
2.使用方法：
a.Day1：按实验需要将细胞铺板(比如12孔板)。细胞数以第2天密度约50%为宜。37℃培养过夜。
b.Day2：病毒感染前，从-80℃冰箱取出病毒后冰浴融化，参考相关文献或者根据预实验得到的MOI值用新鲜完全培养基将病毒稀释成所需浓度，并加入适量Polybrene，轻轻混匀。
c.吸除细胞原有培养基，将病毒液+培养基+Polybrene加入细胞中，轻轻摇匀。37℃继续培养。
d.Day4：吸除含病毒的培养基，换为新鲜的培养基。此时可以加入相应抗生素进行筛选。
e.Day5-6：根据需要收集细胞检测目的蛋白的表达。
07 双抗
名称：青霉素-链霉素混合溶液（100×） / Penicillin-Streptomycin Solution（100×）
规格：100mL
存储：-20℃保存，24个月有效。建议分装冻存，避免反复冻融。
产品简介：青霉素-链霉素混合溶液(100×双抗)(Penicillin-Streptomycin Solution, 100×)是专门用于细胞培养的双抗，经过滤除菌，可以直接添加到细胞培养液内。
配制：青霉素-链霉素混合溶液(100×双抗)中，青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml。该溶液用0.9%NaCl或PBS配制。在细胞培养液中推荐的青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml，即按照100倍稀释使用即可。
08 DMEN培养基
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 是一种广泛使用的基础培养基，适用于多种哺乳动物细胞培养，包括HeLa, 293, Cos-7, 和 PC-12等细胞系，以及原代成纤维细胞，神经元，神经胶质细胞，人脐带静脉内皮细胞，平滑肌细胞等，DMEM与MEM相比，含有四倍浓度的氨基酸和维生素。
DMEM含有4.5 g/L葡萄糖（高糖型）或1 g/L（低糖型）。
网上找来的DMEM/F-12：GibcoDulbecco's Modified Eagle Medium：F-12培养基。采用高品质配方，用于哺乳细胞培养物具有更优的可靠性、一致性和改良型对照。
DMEM/F-12 是一种应用广泛的基础培养基，用于促进许多不同哺乳动物细胞的生长，包括 MDCK、神经胶质细胞、成纤维细胞、人内皮细胞和大鼠成纤维细胞。该配方采用 DMEM 与 Ham's F-12的 1：1 混合物，结合了 DMEM 的高浓度葡萄糖、氨基酸和维生素与 F-12 的多种成分。
09 细胞传代原理
细胞传代就是对细胞一分为二或者更多，然后继续培养。如果不传代，营养液耗竭，细胞长满培养瓶子，结果就是细胞死翘翘。
一、细胞传代的时机：
a.细胞密度：正常细胞生长至彼此汇合时，也就是细胞和细胞的边缘开始接触时，就需要传代了
b.培养基营养成分耗尽：一般情况下，培养基颜色变黄、pH下降，同时伴随细胞密度较之前的增加，就是传代的信号。
c.距离上次传代的时间：如果我们每一次都严格按照指定的时间节点，和保持一致的细胞浓度去传代，那么传代时机就可以按照固定的时间点来执行。
杨柳岸，晓风残月。
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