文/图 中国水产科学研究院长江水产研究所 杨移斌，艾晓辉
新冠疫情接近尾声了，而鱼类瘟疫还在不断暴发。自2019年春天长江中下游等全国草鱼主养区域出现了暴发性死亡现象以来，几乎每年初夏交替之际，水产养殖动物特别是需越冬生长的均需渡劫一样，如斑点叉尾鮰、黄颡鱼等，多种鱼类的主养区均暴发大规死亡，甚至到了空塘的地步。文章就本实验室研究的黄颡鱼及斑点叉尾鮰病害进行分享，供参考交流。
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斑点叉尾鮰杀鲑气单胞菌病
2016年2月，湖南省常德地区网箱养殖的斑点叉尾鮰出现持续性发病，以体表溃烂为主要特征，发病水温为12-15℃，死亡率在后期呈暴发性上升的趋势，因发病规格集中在1 kg及以上，总死亡率达到50%左右，给养殖户带来了很大的经济损失。研究从患溃疡症斑点叉尾鲙中分离到一株致病性菌株ry01，生理生化鉴定和16S rDNA基因序列分析表明ry01株为鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes)。人工感染该菌后发病鱼表现为与自然发病类似症状，且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对斑点叉尾鲙的半数致死量为4.17×10⁶ CFU/mL。菌株ry01对强力霉素及左氧氟沙星等高度敏感，为斑点叉尾鲙该病防控提供了理论依据。具体参考杨移斌,胥宁,董靖等.斑点叉尾源杀鲑气单胞菌无色亚种分离鉴定及药敏特性[J].水生生物学报,2017,41(04):787-792。近年来该病在大水面网箱养殖的斑点叉尾鮰中频频出现，值得进一步关注。
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斑点叉尾鮰气单胞菌病
2015年10月对湖南常德地区网箱斑点叉尾暴发性病害进行了临床诊断。网箱架设水域生活垃圾较多,水质发黑，氨氮偏高。斑点叉尾发病死亡率高，发病死亡规格主要集中在商品鱼。其自然发病症状表现为体表腹部有明显出血点，肛门红肿有大量血水流出。解剖后发现其肝脏及脾脏发黑，肾脏严重充血,心脏肿大，腹腔内大量血水。从湖南常德某养殖场死亡的斑点叉尾(Ictalunes punctatus)肝脏、肾脏、腹水及血水中分离到一株致病性菌株zy02。对该菌进行了形态特征观察、理化特性测定及分子生物学方法鉴定,用PCR方法同时扩增其16S rDNA和gyrB基因，分析了16S rDNA和gyrB两种基因序列的同源性，并构建了系统发生树。经生理生化测定和16S rDNA与gyrB基因序列分析，zy02株为中间气单胞菌。人工感染该菌后发病鱼表现为与自然发病类似症状，且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对斑点叉尾的半致死浓度为3.89×10⁶CFU/mL。菌株zy02对多西环素、庆大霉素及左氧氟沙星等高度敏感；对红霉素中度敏感;对阿莫西林、磺胺异噁唑、克林霉素及利福平等5种药物耐药。本研究为斑点叉尾该病防控提供了理论依据。参考杨移斌,杨秋红,胥宁等.斑点叉尾(Ictalunes punctatus)源中间气单胞菌(Aeromonas media)分离鉴定及药敏特性[J].海洋与湖沼,2016,47(06):1199-1204。
2015年9月湖北仙桃某养殖场出现斑点叉尾鮰大规模死亡的病例。斑点叉尾鮰死亡呈暴发性，发病迅速，死亡快，死亡率高约为20%。其主要症状表现眼球突出，胸鳍腹鳍及头部有出血，黏液增多，解剖时发现肾脏充血发黑，肝脏呈土灰色，脾脏黑色，腹腔有大量血水积聚，肠道出现红肿无食物。从患病斑点叉尾鮰血水、腹水及重要组织器官中分离纯化病原菌，并进行分离株理化特性测定、gyrB序列分析及回归感染实验，并通过K－B法进行分离菌株药物敏感性分析。结果显示，回归感染实验鱼出现与自然发病类似症状，并经细菌再分离获得相同分离株，表明分离株是引发本次斑点叉尾鮰疾病的病原菌。分离株理化特性与温和气单胞菌基本一致，gyrB基因序列分析分离株与温和气单胞菌同源性达100%，故分离株鉴定为温和气单胞菌。分离株对多西环素及头孢噻肟高度敏感，对氟苯尼考、阿奇霉素及左氧氟沙星中度敏感。分离菌株是斑点叉尾鮰病原菌，紧急时可选用多西环素等药物进行防控。参考杨移斌,胥宁,董靖等.斑点叉尾鮰病原中温和气单胞菌的分离鉴定及药敏特性分析[J].中国渔业质量与标准,2017,7(04):45-50。
对盐城2022年春夏之际斑点叉尾鮰大规模死亡病因进行现场调查，调研了盐城市养殖斑点叉尾鮰较集中的射阳、大丰、东台等三个县区，收集样品7个，共计28尾发病斑点叉尾鮰，发病症状主要表现为体表溃疡，发红有出血点，肛门红肿，肠道发炎红肿，脾脏发黑。经细菌分离纯化获得29株分离株；经16S rRNA鉴定发现21株是维氏气单胞菌，其余为芽孢及希瓦氏菌等。
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斑点叉尾鮰病毒性出血病
2016年10月中旬到11月底，湖北仙桃某大型养殖场养殖的斑点叉尾鮰出现批量死亡，使用大量调水药物及碘制剂消毒均未能有效控制疾病恶化，死亡间隔几天出现，累积死亡近500kg，造成较大经济损失。取患病濒死斑点叉尾鮰进行临床诊断，发现斑点叉尾鮰鳍条基部严重充血，眼球微凸出，腹部微胀，而体表无其他明显症状，鳃部有轻微充血肿胀；解剖发现患病斑点叉尾鮰体腔有黄色液体，肝脏灰黄色，脾脏肾脏发黑，肠道发白无发炎等症状，肠道无食物。经取体表黏液及各组织压片，在光学显微镜下观察，未发现寄生虫等病原体。冷冻取病样回实验室进一步分析，查找可能的病原。经实验及文献比对基本确定本次斑点叉尾鮰发病是由病毒引起。参考杨移斌,宋怿,艾晓辉.斑点叉尾鮰暴发性出血病防控[J].渔业致富指南,2017,No.474(18):58-59。
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斑点叉尾鮰鲁氏耶尔森氏菌病
2016年1-2月湖南安化网箱养殖斑点叉尾鮰出现大规模暴发性持续性死亡，发病迅速，发病死亡率很高，发病水温在5～15℃。经调查，斑点叉尾鮰养殖区域养殖用水未受到大规模污染，养殖水质状况符合渔业用水标准。通过对患病濒死斑点叉尾鮰临床诊断，发现该病的典型症状为发病初期病鱼表现为行动迟缓，体质瘦弱;体表胸鳍及头部有明显的出血症状，解剖发现组织器官有不同病变及充血，尤其是肾及脾严重充血等，腹腔有大量腹水;肠道多黏液，肠壁薄而发红，有出血症状。镜检没有发现寄生虫等感染。。本研究从患病濒死鱼肝、脾、肾分离到1株致病菌，对其进行常规理化特性、分子生物学、人工感染实验以及药敏性检测。结果显示，分离菌株理化特性与鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)特征相符，与NCBI中登录的鲁氏耶尔森氏菌的16S rDNA基因同源性达99%以上，在系统发育树上与鲁氏耶尔森氏菌聚为一族。人工感染鱼出现与自然发病相似症状，并能够从发病鱼组织中再次分离到相同病原菌，表明鲁氏耶尔森氏菌为斑点叉尾鮰该病病原菌。该分离菌株对氟苯尼考、多西环素及新霉素等药物高度敏感，本研究为斑点叉尾鮰暴发性出血病防控提供了理论依据。参考杨移斌,刘天强,阳涛等.斑点叉尾鮰冬季大规模死亡病原分离与鉴定[J].中国渔业质量与标准,2016,6(06):53-58.
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斑点叉尾鮰源普通变形杆菌病
2016年六七月湖北仙桃养殖场的斑点叉尾鮰出现一种病害，发病死亡率30%，引起严重经济损失。发病斑点叉尾鮰体表轻微溃烂，肛门有淡黄色液体流出，经解剖后发现肝脂变严重、轻微坏死，脾肾轻微充血，肠道严重糜烂坏死。从患病斑点叉尾鮰病灶、肝、脾和肾分离纯化病原菌，经理化特性测定及16S rRNA基因序列分析对其进行鉴定，开展人工感染试验，并利用纸片扩散法进行药敏特性分析。【结果】分离菌株k1为本次引发斑点叉尾鮰病害的致病菌，其对斑点叉尾鮰的LD50为2.82×105 CFU/g。菌株k1理化特性与普通变形杆菌Proteus vulgaris基本一致，16S rRNA基因序列与普通变形杆菌相似性最高，综合判定分离菌株为普通变形杆菌。分离菌株k1对环丙沙星、头孢唑林及头孢拉定等12种抗生素高度敏感，对苯唑西林、阿莫西林及痢特灵等7种抗生素耐药。【结论】分离菌株k1是斑点叉尾鮰病原菌，养殖时可选用氟苯尼考等药物进行防控。参考杨移斌,余琳雪,杨秋红等.斑点叉尾鮰源普通变形杆菌的分离、鉴定及药敏特性[J].微生物学通报,2017,44(10):2391-2397.DOI:10.13344/j.microbiol.china.160954。
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黄颡鱼及斑点叉尾鮰海豚链球菌病
2016年7至8月福建漳州某黄颡鱼养殖场暴发养殖黄颡鱼大量死亡，发病率在40%～60%，病鱼死亡率接近90%，发病黄颡鱼在口腔与下颌、体表两侧及鳍条基部均有出血症状，肛门红肿有红色液体流出;解剖可见肝肾脾等出现肿胀、充血，部分病鱼有腹水。从患病黄颡鱼肝、肾及脾分离纯化病原菌，经理化特性测定及16S rＲNA序列分析对其进行鉴定，开展人工感染试验，并利用纸片扩散法进行药敏特性分析。结果显示，分离菌株si222对黄颡鱼的LD50为2.63×10⁴ cfu·g-1，其理化特性与海豚链球菌(Streptococcus iniae)基本一致，16S rＲNA序列与海豚链球菌同源性为100%，综合判定分离菌株为海豚链球菌。菌株si222对苯唑西林、头孢拉定、克林霉素及氯霉素利福平等11种抗生素高度敏感;对青霉素、阿莫西林、磺胺异噁唑及氟苯尼考等6种抗生素耐药。参考杨移斌,胥宁,杨秋红等.黄颡鱼源海豚链球菌分离、鉴定及药敏特性[J].浙江农业学报,2017,29(06):903-909。斑点叉尾鮰海豚链球菌病症状与黄颡鱼类似。
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黄颡鱼溶血性腹水病
2017年6-7月，湖北省荆州某养殖场暴发黄颡鱼大规模腹水病，发病率50%左右，死亡率高，导致了重大经济损失。从濒死黄颡鱼腹水中分离到一株细菌HS01，对分离株理化特性及DNA序列进行检测，根据理化特性、16S rＲNA和gyrB基因序列比对，分离株HS01为嗜水气单胞菌。人工感染该菌后发病鱼出现与自然发病类似症状，并表现强毒力，对黄颡鱼的半致死剂量为2.51×105 CFU·g-1，且从病灶中分离到与感染菌一致菌株，因此确定嗜水气单胞菌是此次黄颡鱼溶血性腹水病的病原。分离株对头孢唑肟、头孢噻肟、奈替米星及氟苯尼考等10种抗生素高度敏感;对头孢拉定、链霉素、新霉素及卡那霉素等6种抗生素中度敏感;对阿莫西林、青霉素、妥布霉素及红霉素这4种抗生素耐药。本研究为黄颡鱼溶血性腹水病防控提供了理论依据。
腹水病是是水生动物养殖过程中常见及危害较大的一种疾病，主要症状为腹部膨大，而又因是否有体表出血及肛门是否红肿分为溶血性与非溶血性腹水，溶血性腹水病是由细菌性病原引起，而非溶血性腹水病多是由营养代谢障碍引起的。目前已报道的发生腹水病的种类有异育银鲫[25]、中华鳖[26]、鲢鳙[27]、乌鳢[28]、日本鳗鲡[29]及牛蛙[30]等，大多数是溶血性腹水病。因腹水病早期症状不明显，而一旦其腹水积累到一定量，腹部膨大，是很难治疗的，因此在养殖生产过程中常引起重大经济损失。
黄颡鱼此次暴发严重疾病导致大量死亡，其主要症状表现为腹部膨大，肛门红肿溃烂，解剖发现黄颡鱼腹腔有大量腹水，而腹水离体几分钟后即形成胶体状，肝肾脾有充血肿大，肝发黄，肠道无食物，通过症状与前人研究[25]比对可知，故本次黄颡鱼疾病是典型的溶血性腹水病。参考杨移斌,艾晓辉,宋怿等.黄颡鱼溶血性腹水病初探[J].浙江农业学报,2019,31(08):1239-1248及杨移斌.黄颡鱼三例重大病害防控思考[J].渔业致富指南,2022,No.578(02):60-61.
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黄颡鱼体表溃烂症
2018年9-10月，浙江湖州某养殖场黄颡鱼出现体表溃烂症，发病率很高，而且造成养殖黄颡卖相不好，价格低，给养殖户造成了重大经济损失。本实验从患病黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)病灶分离纯化病原菌，经ITS序列分析对其进行鉴定，开展人工感染试验，并利用纸片扩散法进行药物筛选。结果显示，分离菌株HSZJ01为本次引发黄颡鱼病害的致病菌，菌株HSZJ01的ITS序列与不规则毛霉(Mucor irregularis)同源性最高。参考杨移斌,姜兰,宋怿等.黄颡鱼体表溃烂症初步研究[J].淡水渔业,2019,49(05):51-55.DOI:10.13721/j.cnki.dsyy.2019.05.008及杨移斌.黄颡鱼三例重大病害防控思考[J].渔业致富指南,2022,No.578(02):60-61.
更多病例参考杨移斌.一例黄颡鱼急性肠炎病诊断及防治病例[J].渔业致富指南,2022,No.586(10):67-68.等
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防控思考
目前鱼类主要微生物病原包括细菌、真菌及病毒等，其通用的分离鉴定方法主要是培养法，即选择合适的培养基对目标生物进行培养、纯化，继而开展相关鉴定工作，其最重要的一关键点即培养微生物。病原微生物分离纯化技术的发展给鱼类病原微生物鉴定带来极大便利，推动了鱼类病原学的革命性发展。随着研究的深入及新技术的发展，我们认识到并非所有病原微生物均可培养。而随着养殖环境的恶化，鱼类病原呈现多样性，一些不可培养的(或者常规条件难以培养)细菌、真菌也可能成为鱼类病原菌，因此迫切需要革新病原分离鉴定的技术。
16S rDNA高通量测序技术是主要基于细菌16S rDNA基因在功能上的高度保守性以及又有一定程度的高变性，可以真实全面反映样品中细菌群落结构，从而检测到可培养以及不可培养的细菌种类。随着现代高通量测序技术的发展，16S rDNA高通量测序技术已经被普遍使用于各个领域进行细菌多样性分析。针对水生动物细菌性病原，可采取16S rDNA高通量测序技术来解决难培养或者不能培养的细菌感染引起的疾病病原确定问题，直接取病样测序获取发病鱼相应病灶部位及相关组织器官细菌群落，通过高通量获取细菌种属信息，从而对可分离培养的细菌制定针对性的分离培养措施，对不可培养细菌也可了解其大致信息以便进行毒力相关研究。参考杨移斌.鱼类细菌性病原分离鉴定新方法[J].科学养鱼,2020,No.375(11):46-47.DOI:10.14184/j.cnki.issn1004-843x.2020.11.024。
医生对病人首先要诊断出，病人得的是什么病，然后才能对症施药，正确的诊段，才会让病人好的更快。
鱼类病害诊断也在于明确疾病种类，掌握发病原因，制定科学的治疗方法，达到标本兼治的目的，并杜绝头疼医头，脚痛医脚的尴尬。
鱼类病害诊断的是病因，而不仅仅是病原体，诊断需要遵循一定的方法及程序，不建议教条式诊断鱼病，不建议仅仅检测病原诊断疾病。
参考杨移斌.鱼病诊断大于等于病原鉴定[J].渔业致富指南,2021,No.565(13):64-66及杨移斌,艾晓辉,杨先乐.基于鱼类疫情探讨鱼类病原鉴定工作的意义[J].科学养鱼,2020,No.373(09):46-47.DOI:10.14184/j.cnki.issn1004-843x.2020.09.023。做好药敏实验，掌握病原耐药性。参考[1]杨移斌,艾晓辉,宋怿.水产动物病原药物敏感性实验技术[J].科学养鱼,2017,No.339(11):63.DOI:10.14184/j.cnki.issn1004-843x.2017.11.035及杨移斌.水生动物病原药敏实验解析[J].渔业致富指南,2021,No.571(19):68-72。
预防为主，有病治病。对于鱼类瘟疫加强预防，保肝护胆增强免疫，不完全追求高产，高产不等于高效益。接种疫苗，添加多糖增强免疫，保护肠道促消化，秋天做好能量储备，春冬天气晴好适时少量投喂，鱼类开口吃食讲究循序渐进。做好底质改良，不排斥也不能不迷信新技术新方法，能动手尽量自己动手，解决问题主要靠细心、勤劳及责任心，加强管理。
最后，建议提高渔医的社会认可度，给予从业者足够的理解与尊重。水生动物疾病防控是技术性、专业性极强的学科，是水产从业人员“事业可持续发展”的最后保障，绝不是为营销服务的一种手段。我始终认为水产养殖过程中非感染性疾病要多于感染性疾病，只是没有很好地区分原发性感染疾病以及继发性感染疾病，导致只要发病就认为是感染性疾病，从而在治疗方向上就发生了偏差。因此鱼病诊断与科学防控应建立标准化程序（SOP），并尽快让水生动物类执业兽医上岗，加强培训，更新专业知识，做到专业的人干专业的事，降低病害引起的经济损失，从而促进乡村振兴工作。当然渔医自始至终是水产养殖的辅助，重点还是在于养殖管理，不可本末倒置。
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本文为“水产前沿”独家稿件，版权合作，敬请联系wx@fishfirst.cn。
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