文/图 湛江恒兴南方海洋科技有限公司、湛江市海洋与渔业发展研究中心、南海生物资源开发与利用协同创新中心 李色东 湛江恒兴南方海洋科技有限公司、南海生物资源开发与利用协同创新中心 陈禄芝 余霞艳
针对养殖户反映的南美白对虾生长缓慢的现象，本研究采用 EHP（虾肝肠胞虫）和 IHHNV（传染性皮下及造血组织坏死病毒）实时荧光定量 PCR（RT-PCR）检测方法，对粤西地区的南美白对虾亲虾、虾苗、成虾、饵料、鲜活饵料和育苗与养殖水体进行检测，分析这两种病原在种苗生产与对虾养殖中的流行情况。
一、材料与方法
1、试验材料
本试验用到的虾苗、种虾、成虾、种虾饵料和育苗与养殖用水样品均由湛江恒兴南方海洋科技有限公司实验室收集，样品分别采自于粤西区域的育苗与养殖场。
EHP荧光定量 PCR检测试剂盒，荧光定量 PCR仪（TL988），解剖剪等。
2、试验方法
（1）样品处理
虾苗：用生理盐水冲洗虾苗表面3次以上，随机挑取 10尾，置于玻璃研磨器中充分研磨后，用磁珠法提取DNA。亲虾、成虾：分别取鲜活虾体的肝胰脏 0.1g（约黄豆大小），同上。种虾饵料：取种虾饵料 0.1g，同上。水样：分别量取 80mL的水样，高速离心8min，弃上层清夜；吸取 1mL生理盐水，充分悬浮沉淀，转入 1.5mL的 EP管中，高速离心5min，弃上层清夜，同上。
（2） EHP荧光定量 PCR检测
以上述提取的 DNA为模板，进行实时定量荧光 PCR检测。20μL反应体系，参照试剂盒的说明书进行配置。扩增条件：95℃预变性 2min；94℃变性10S，60℃退火 30S（此处采集荧光，设置为 FAM绿色荧光），共 40个循环。
二、结果与分析
1、多种样品的 EHP和 IHHNV检测结果
用 RT-PCR检测方法对粤西地区的有关南美白对虾样品进行 EHP和IHHNV检测，结果汇总后如表 1所示。从表1中可知，共检测的 87份样品中，EHP的检出率为41.38%，IHHNV的检出率为 12.18%。EHP检出率较高的为成虾和种虾样品，分别为 93.75%和66.67%。同样，IHHNV检出率也较高分别为 31.25%和38.10%。其中未经处理过的 2份海水样品均有检出 EHP和IHNNV，但经过消毒处理后的育苗与养殖用水未检测到 EHP和IHHNV。
2、进口样品与本地样品的 EHP和IHHNV检测结果
分别对进口种虾、进口一代苗、本地种虾和本地虾苗进行检测，结果见表2。从表 2可知，6份进口种虾样品中，EHP检出率较低为 33.33%，且未检测到 IHHNV。同样，进口的一代苗中，EHP检出率为30.00%，IHHNV的检出率较低，为 10%。本地种虾的 EHP和IHHNV检出率最高，分别为 80.00%和53.33%。本地虾苗的 EHP检出率为21.74%，IHHNV检出率为34.78%。
3、不同成虾样品的 EHP和 IHHNV检测结果
为了探究南美白对虾感染 EHP和IHHNV对生长的影响，笔者对不同养殖环境（不同养殖场）、不同养殖时长和不同规格的对虾样品进行了上述病原的检测。不同养殖场成虾检测结果如表3所示，A养殖场的肠胞虫载量最高，对虾平均日增长体重（简称“日增长量”）最低为 0.039g。C养殖场的肠胞虫含量最少，其平均日增长量比其它两个场的高，为 0.090g。3个养殖场的样品均未检测出IHHNV。
B养殖场不同养殖时长对虾的检测结果（见表 4）。3份样品都有检出EHP，其日增长量最大的 B-24样品，EHP载量相对最低；而日增长量最小的 B-17样，EHP载量相对最高。另在B-23的样品中有检出IHHNV。
根据以上检测对虾的养殖时长和体重以及对其 EHP的检测结果，得到日增长量与 EHP载量指数（ERCEHP）的关系图（见图 1）。从图中可见对虾的日增长量与 EHP载量指数呈一定的对数关系（R2=0.5746）。
三、讨论
近年来，肠胞虫在全球南美白对虾养殖业中流行范围很广，先后在泰国、马来西亚、印度等国检测出该病原，在我国江苏沿海和广东沿海地区也多有检出。2015年浙江省水产技术推广站对浙江地区的 134份虾苗样品进行检测，EHP的检出率高达53.8%，HHNV的检出率为 25.4%；江苏沿海地区南美白对虾 EHP的发病率约为 25%。本研究对粤西区域的 87份样品进行检测，EHP的检出率为41.38%，IHHNV的检出率为 12.18%。另在检测样品中，两份不同海域的海水样品有检测到 EHP和 IHNNV，而经过消毒处理过的养殖用水和育苗用水中未检测出上述病原，可见事先进行水处理对养殖和育苗的重要性。EHP和 IHHNV的检出率较高的为成虾样品，可见在成虾养殖过程中最容易感染到该两种病原。分别对粤西地区进口种虾和本地选育种虾进行调查，结果发现进口种虾中 EHP的检测率为33.33%，没有检出 IHHNV；而在一代苗中，IHHNV检出率为 10.00%，说明在对虾在幼体生产及育苗过程中感染到了IHHNV。
从本文对不同养殖场、不同养殖时长和不同规格对虾的检测结果中发现：3个养殖场的对虾 EHP载量差异大，EHP载量高的对虾日增长量最小，而日增量大的 EHP载量底；在 B养殖场不同时长的对虾检测结果中，发现养殖时长与 EHP载量没有相关性，其感染量基本相同；B养殖 20号池不同规格的对虾 EHP载量指数一致。综上所述，对虾 EHP的载量与养殖环境有紧密联系，环境不同其 EHP的载量指数不同。因此在对虾养殖过程中，养殖水体、饲养饵料以及养殖工具等环境因素的严格把关，对控制对虾感染 EHP病原极为重要。
对虾日增长量与 EHP载量指数呈一定的对数关系（R病毒 =0.5746），EHP载量指数增大，日增长量呈对数下降。结果与刘珍的试验结果称负相关性吻合。但由于试验局限，R 2较低，有待后期试验进一步的优化。
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