建立可重复、大规模、高通量的临床级细胞外囊泡(EV)的生产和纯化方法对于EV的治疗应用开发至关重要。超速离心(U/C)、超滤、免疫沉淀和尺寸排阻色谱法(SEC)等方法已被用于分离EV,每种方法都面临诸如效率、颗粒纯度、处理时间和/或样品体积的限制。美国国家癌症研究所的研究人员通过生物反应器培养、切向流过滤(TFF)和制备型SEC的策略,开发了一种cGMP级别的方法用于EV的大规模生产、浓缩和分离。研究人员应用此纯化方法分离携带新型人免疫刺激性细胞因子融合蛋白异二聚体IL-15(hetIL-15)/lactadherin多重复合物的工程化EV。将稳定表达融合细胞因子的HEK293细胞在中空纤维生物反应器中培养。收集条件培养基并分离EV,比较三种方法:U/C、SEC、TFF+SEC。SEC显示出与U/C纯化相当的颗粒回收率、尺寸分布和hetIL-15密度。相对于U/C,SEC制剂使铁蛋白浓度(一种主要的蛋白质复合物污染物)降低了100倍。比较蛋白质组学提示SEC还降低了与EV无关的细胞质蛋白的丰度。TFF和SEC的组合使得对大起始体积进行批量处理成为可能,并可生产具有生物活性的EV,且不会显著改变颗粒产量或尺寸、形态和hetIL-15/lactadherin密度的变化。总之,生物反应器培养与TFF+SEC的组合是用于生产高度纯化的、具有生物活性的携带hetIL-15/lactadherin的EV的可扩展的高效方法,其可用于靶向癌症的免疫治疗方法。
具体方法如下,
1. 细胞培养: 细胞经大的生物反应器培养收取细胞培养上清,300×g离心7 min,取上清3000×g再离心15 min ,取上清进行下一步或冻存于-80度。
2. EV纯化:上一步上清20000×g离心45 min,取上清经22 μm过滤。110000×g超速离心3 h的到沉淀用PBS重悬。重悬的EV经短暂的18000×g离心3 min,去除残余的大聚合物。
3. 分子排阻色谱法:细胞上清经高效液相色谱(HPLC)色谱柱进行EV分离。
4. 切向流过滤(TFF):TFF主要用于去除细胞上清中的非EV成分并对上清进行浓缩。具体来说,细胞上清用等量的PBS稀释后经750 kDa和05 μm孔径过滤,过滤结束后再想浓缩的上清中加入等量的PBS稀释再过滤,如此重复5次,最终得到经TFF超滤浓缩的细胞上清。
参考文献:
Watson, D. C., et al. (2018). "Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes." J Extracell Vesicles 7(1): 1442088.
编辑:土豆
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