【整理】各类体液EVs的提取（内含赠书福利）

文末有《细胞外囊泡：基础研究与临床应用》书籍赠送！

细胞外囊泡（EV）是细胞间通讯载体，这是由于它们转移蛋白质、脂质和核酸的能力，从而影响受体细胞和亲本细胞的各种生理和病理功能。之前，我们常常谈到细胞培养上清中的外泌体的提取，今天为大家整理一下各种体液（包括血液、尿液、唾液、脑脊液、胆汁、乳汁以及植物、微生物等）中外泌体提取。

体液中的EV是不同来源的囊泡的混合物。EV的脂质膜可封装并保护其内容物免受体液中存在的降解酶的侵害，从而将其作为生理和病理信息的来源加以保护，可以远距离传输。

来自人体不同组织的细胞通过EV的分泌进入体液进行通信。

Yáñez-Mó, M., etal. (2015). Journal of Extracellular Vesicles 4.

血液EVs

对小的细胞外囊泡（sEVs）作为蛋白质和核酸的功能性载体的兴趣不断增长。血液中存在大量的sEV，但是缺乏用于sEV分离的标准化方法极大地限制了我们研究它们的能力。有研究使用大鼠血浆系统地比较了两种常用的sEV分离技术：超速离心（UC-sEVs）和尺寸排阻色谱（SEC-sEVs）。SEC-sEV包含大量的APOB⁺脂蛋白和大量的非sEV蛋白。与SEC相比，UC提取的血浆sEV纯度明显更高。此外，sEV的功能活性可能取决于所使用的分离方法，而并不仅仅sEV的数量。

血液EVs的提取

血液EVs的提取相对其它体液还是比较常见的，这里以人源血浆样品为例，将血样在室温下以1600g离心15分钟以去除细胞。将上清液血浆转移至新的Eppendorf管中，并在室温下以10,000 g离心30分钟，以去除碎屑和大囊泡。立即使用血浆样品或将其冷冻在-80ºC下。

用PBS将1毫升（用于表征实验）或4毫升（用于功能实验）血浆样品稀释至7-8 mL，并在100,000 g，4ºC下超速离心70分钟将sEV沉淀。丢弃上清液，将sEV重悬于PBS（约7-8 ml）中进行洗涤。在100,000g，4ºC下进行第二次UC运行70分钟。富含sEV的沉淀物用PBS重悬至最终体积为100–200 µL，并冷冻于-80ºC。

Takov, K., et al.(2019). J Extracell Vesicles 8(1): 1560809.

尿液EVs

尿液中脂质膜的存在最早是在1990年代初期就被描述的。假设这些膜来自细胞内囊泡，它们以某种方式释放到尿液中。但是，直到2004年，尿液EV才首次如此描述，现在估计总尿蛋白组分中只有约3％来自EV。尿液EV是生物标志物的库和肾内信号传导的潜在介质。

尿液EVs的提取

以人源尿液样本为例，顺序差异离心和超速离心的方法已成为分离尿液细胞外囊泡的最常用方法。依次进行的方法是从低离心力3,000 g离心除去细胞，然后17,000 g除去碎片，随后在超速离心机中以更高的离心力（例如200,000 g）离心，从上清液中沉淀出尿液细胞外囊泡。

Merchant, M. L.,et al. (2017). Nat Rev Nephrol.

唾液EVs

唾液中的EVs含有蛋白质和多种不同的RNA，这些蛋白质可被口腔角质形成细胞和巨噬细胞内化并改变其蛋白质表达。这表明唾液源性EVs具有生物活性。由于培养物中的唾液腺上皮细胞释放出EV，并且可以在唾液来源的EV上检测到上皮细胞标记物，因此这些细胞很可能是唾液中发现的EV的来源。除了上皮细胞标志物外，还可以在唾液来源的EVs上鉴定出粒细胞标志物CD66b，这表明唾液来源的EVs主要来自上皮细胞和粒细胞。有研究报道，唾液中鉴定出两种类型的EV，一种大小不同的种群（30-250 nm）和一种大小均匀的种群（20-80 nm）。这两个种群的蛋白质和RNA含量不同。

唾液EVs的提取

以人源唾液样本为例，全唾液收集和预处理：

受试者在收集唾液之前至少1小时不要进食、饮水或进行剧烈的体育锻炼。在上午9:00到11:00之间收集唾液样品，通过吐痰以一致的方式将未刺激的唾液样品收集到50 mL离心管中，并保存在冰上。唾液收集后，立即对样品进行过滤或超声处理。

从15 mL唾液中提取：

该过程的示意图如下图1a（左）所示。将15 mL唾液与15 mLPBS混合，如上所述进行预处理，然后在4°C下于2,600 g离心30分钟以清除细胞、细菌和潜在的食物残渣。将上清液收集在38.5 mL超透明试管（#344058, Beckman Coulter）中，并在4°C（L-90K with SW32Ti rotor, Beckman Coulter）下以160,000g离心70分钟以产生粗制EV颗粒。将粗制EV重悬于2.5 mL的2.0 M蔗糖、50％碘海醇或47％碘克沙醇的0.02M HEPES/NaOH，pH 7.2缓冲液中，并如图1b所示，加到包含2.5 mL的2.0、1.6、1.18和0.8 M梯度的蔗糖上，或者，50％、40％、30％和20％的碘海醇，或者，47％、37％、28％和18％的碘克沙醇溶液上。然后，在1 h内，将试管在4°C（SW40Ti转子）下以160,000g离心17 h。离心后，首先收集1.25 mL的顶部馏分作为馏分1，然后收集相间分离2个相邻馏分的四个2.5mL馏分。最后，收集到1.25 mL的底部馏分作为馏分6（图1b）。离心分离后的各级分的密度通过折光仪进行测定。将收集的级分储存在4℃直至分析。

Iwai, K., et al.(2016). J Extracell Vesicles 5: 30829.

脑脊液EVs

脑脊液（CSF）被描述为具有多种功能，可作为血液和大脑之间的中介物，用于营养物质和生长因子的运输，以及作为大脑的缓冲液，可保护大脑组织和供应大脑循环的大血管。脑脊液还参与了毒素和其他代谢副产物的消除。由于EV在中枢神经系统和神经系统疾病中的潜在重要性，因此人类脑脊液中EV的存在引起了人们的极大兴趣。大量研究表明，在人类的脑脊液中存在EV，它们携带信号和细胞内蛋白。研究表明，EV主要通过外泌体表面蛋白例如PrPC的螯合淀粉样蛋白b蛋白（Ab）寡聚物来中和体内Ab的突触可塑性破坏活性。这些表明EV对Ab的积累具有保护作用。

脑脊液EVs的提取

以临床脑脊液样本为例，6 mL CSF的两个独立库（CSF1和CSF2）用于蛋白质组学分析。0.5 mL的CSF样本来源于常规诊断中使用的残留样品，并保存在-80°C。EV分离简而言之，将约6mL的CSF在4°C下以500×g离心10分钟以除去所有完整细胞，小心收集上清液，并以2000×g离心15分钟，最后以20,000×g离心45分钟去除细胞碎片。然后将上清液转移至超速离心管中，并使用40Ti转子（Beckman Coulter）在超速离心机中以100,000×g离心2 h。去除可溶性CSF（上清液，SN），将含EV的沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，仔细洗涤并以100,000×g离心2 h以收集最终的EV沉淀。所有离心步骤均在4°C下进行。

Chiasserini, D.,et al. (2014). J Proteomics 106: 191-204.

胆汁EVs

胆汁是一种有助于消化并将脂肪分解为脂肪酸的液体，然后可被消化道中的细胞吸收。胆汁主要由胆固醇、胆汁酸和胆红素组成。在结扎胆管的大鼠的胆汁中发现了EV，表明体内存在胆道EV。此外，胆汁EV参与胆管细胞的调节机制和增殖。

胆汁EVs的提取

以临床胆汁样本为例，

1.   进行内镜逆行胰胆管造影（ERCP）。患者仰卧并插管。
2.   将十二指肠镜穿过患者的口腔，并将其插入十二指肠的第二部分。
3.  通过插入预装有0.035英寸（0.9毫米）亲水性导丝的三腔括约肌切开器，选择性   地插入胆总管。
4.  在荧光镜引导下将导丝推进到左肝管，因为有时可能很难将囊性管与右肝管区分   开，然后将括约肌切开器推进胆管5 cm以获得稳定的位置。
5.  卸下导线，通过鲁尔锁将10毫升注射器连接到导线端口，并使用10毫升负压吸取   胆汁。
6.  重新插入导丝并通过注入口注入造影剂以使胆道树浑浊，取出装有胆汁的注射器   以进行ERCP。
7.  将收集的胆汁转移到15 mL冰上的试管中，并保持在冰上，直到准备进行离心步   骤为止。

注意：戴手套以保护自己和样品！将胆汁视为可能的感染源，因为它可能含有肝炎病毒颗粒！

• 将样品放在冰上。进行步骤1.2或在4°C下以500 g离心10分钟，然后在-80°C下冷冻直至进一步使用。
• 将400 µl胆汁转移至微量离心管中，并通过在4°C下以300 g离心10分钟来去除细胞和细胞碎片。
• 上清液转移至新的微量离心管中，然后在4°C下以16,500 x g离心样品20分钟，以清除上清液中的其他碎片。
• 收集上清液，并用0.2 µm滤器在生物安全柜中进行过滤。
• 用移液器吸取已过滤的上清液至超速离心管中，并加入PBS，使试管充满2/3以上。如果试管中的液体少于该值，则离心过程中试管会塌陷！
• 通过在4°C下以120,000 g超速离心70分钟来沉淀外泌体。离心后，查看超速离心管底部，有时会看到黄色的小颗粒。这些是外泌体。小心倒出上清液，弃去上清液。
• 对于下游实验，可用少量适当溶液处理沉淀（即，用于蛋白质提取的RIPA缓冲液，用于miR提取的RNA裂解缓冲液）或将其重悬于50-150 µl PBS，可以储存在-80°C以便将来使用，或用于TEM或纳米粒子光学分析表征外泌体的制剂。

Li, L., et al.(2016). J Vis Exp(112).

乳汁EVs

乳汁是一种复杂的体液，富含免疫成分，会影响婴儿免疫系统的发育。研究表明，人母乳中含有EV，但其来源尚不确定。已经确定母乳EV不同于DC EV，并且已经表明它们可能源自母乳中存在的其他细胞，上皮性乳腺细胞，甚至来自可以通过血液到达母乳的人体其他部位循环。有趣的是，在哺乳的前六个月中，在人乳中检测到CD63 EV中免疫相关miRNA（例如miR-181a和miR-17）的高表达水平。深度测序技术已在人乳EV中鉴定出许多与免疫相关的miRNA，这表明此类EV miRNA已从母乳转移至婴儿，可能在婴儿免疫系统的发育中起重要作用。实际上，人类母乳EV有可能在蛋白质水平上影响婴儿的免疫系统。牛奶EV制剂已显示可抑制抗CD3和抗PHA诱导的（活化T细胞）细胞因子的产生，并增加特定种类的T调节细胞的数量。在其他物种中也描述了母乳EV参与新生儿免疫系统发育和成熟的过程。

乳汁EVs的提取

以牛乳为例，将脱脂的牛奶在37°C下预热10分钟，然后在室温下与乙酸[牛奶/乙酸= 100（体积）]混合5分钟，然后在10,000 g下4°C离心10分钟。用0.22 µm的膜过滤上清液，并命名为乳清。使用SW41Ti转子和Optima XE-90超速离心机（Beckman Coulter），将乳清在4℃于210,000 g下超速离心70分钟。将mEV沉淀重悬于PBS中，然后再次超速离心。洗涤后，将mEVs沉淀重悬于PBS中，并通过在4°C下以10,000g离心5分钟除去残留的沉淀物。

Somiya, M., et al.(2018). J Extracell Vesicles 7(1): 1440132.

植物EVs

植物中存在纳米囊泡。来自非原质体液体的脂蛋白囊泡和果汁中的外泌体样囊泡（ELVs）已被分离，表明它们可以载有组分并被受体细胞摄取。

植物EVs的提取

以水果为例，样品预处理：

1. 将新鲜水果放在干净的塑料实验室容器中，并用冷自来水轻轻冲洗5分钟以去除污垢。重复此步骤两次，让水果风干。
2. 剥去水果的外部保护层（外果皮）。
3. 用干净的刀将水果垂直切成两半，然后用手动榨汁器慢慢榨汁。丢弃剩余果肉，将果汁转移到干净的玻璃瓶中。重复此步骤，直到获得所需体积的果汁。挤压应尽可能缓慢进行。
4. 使用PBS将样品稀释至最终体积为500 mL，并立即添加蛋白酶抑制剂混合物。
5. 通过重力滤过放置在滤漏斗上的Whatman滤纸过滤样品，并将滤液收集在干净的实验室玻璃瓶中。这个过程可能很慢，必须定期更换过滤器。
6. 使用具有0.45μm孔径的膜微滤器的一次性、无菌、真空操作的瓶顶过滤系统过滤步骤5中获得的样品。丢弃沉淀。
7. 使用pH计测量滤液的pH。使用1 M Tris–HCl（pH8.6）缓冲液调节样品的pH。

详细超速离心篇幅较长，详见参考文献。

Stanly, C., et al.(2016). Methods Mol Biol 1459: 259-269.

细菌EVs

革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都可以产生EV或外膜囊泡（OMV）。囊泡形成的分子机理尚不完全清楚，但似乎是革兰氏阴性细菌必不可少的保守生物过程。在外膜囊泡（OMV）的形成过程中，周质成分被包埋在其内腔中。对OMV的分析表明，它们的蛋白质和脂质组成不是随机的，因此这些OMV的货物（在管腔内或附着在外部）受未知机制的调节。

细菌EVs的提取

使细菌菌株在200 ml LB中生长，直至OD600约为~0.5，在4°C下以10,000 xg离心10分钟收集无细菌的上清液。将该上清液进一步通过0.45µm过滤器过滤，并在4°C下在Beckman NVTTM65转子中以~400,000 x g超离心1.5 h沉淀OMV。除去上清液后，将OMVs重悬于300µL无菌PBS中。

Vanaja, S. K., etal. (2016). Cell 165(5): 1106-1119.

总之，各类样本的外泌体提取万变不离其宗，以超速离心方法为核心，超速离心的时间和转速可能大同小异。在超速离心之前去除细胞碎片等大颗粒物；超离之后可能附加PBS重新再次超离纯化、甚至上密度梯度离心纯化等。另外，注意不同体液样品的收集方式，以及外泌体提取时样本的预处理。