海肾荧光素酶/近红外萤火虫荧光素酶/腔肠荧光素等一系列荧光活体成像试剂用于肿瘤光热治疗

活体成像技术（optical in vivo imaging）目前主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术，生物发光法是基于荧光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化学发光的原理，将体外能稳定表达荧光素酶的细胞株植入动物体内，与后期注射入体内的底物发生反应，利用光学系统检测光强度，间接反映出细胞数量的变化或细胞的定位。这项技术已被广泛应用于多个领域，常用的有肿瘤或疾病动物模型的建立，并可用于病毒学研究、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究等。

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，许多大中型城市，乳腺癌已居女性恶性肿瘤死亡率的首位。乳腺癌复发转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因，淋巴结阴性的患者中约有24%～30%出现复发转移，淋巴结阳性的患者中复发转移率高达50%～60%，而转移性乳腺癌的5年生存率仅为26%。

萤火虫荧光素酶（Luciferase）是一种常用的信号分子，可以用来标记肿瘤细胞.

一．细胞方法

将带有荧光素luc转酶报告基因的真核表达重组质粒pRc/CMV2-7，利用G418筛选，获得稳染人乳腺癌细胞株MCF-7-luc，并在稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆MCF-7体外评价其发光能力。通过建立裸鼠移植瘤模型，利用活体生物发光成像系统检测肿瘤生长及转移情况，为下一步监测裸鼠移植瘤对药物作用的变化情从而为分析药物对肿瘤的治疗效果提供理想的状况.

G418筛选浓度的确定：

37℃细胞培养箱中常培养,G418按0、200、400、600、800、1000μg/ml设置6个浓度梯度。在细胞接种24h后，加入6孔板中，每个浓度设2个孔在10～14d内全部死亡。每天观察细胞生长情况，死亡最低的G418浓度，即为筛选质粒转染克隆MCF－7细胞的浓度。

1)细胞转染

取对数生长期的MCF－7细胞，将细胞接种于6孔板内待细胞融合度达到80%～90%孔培养板中，TM即可转染。按照Lipofectamine2000试剂盒操作指南进行转染。在250μl无血清、无双抗的DMEM培培养基中加入luc质粒8μg/ml的pRc/CMV2-在250μl无血清、无双抗的DMEM培养基中加入10μlLipofectamineTM2000，室温培育5min。将上述2种稀释液混匀，室温培育30min后加入细胞孔板中，置于培养箱常规培养。

2) 单克隆细胞筛选

转染24h后胰酶消化细胞并按1∶6比例接种到新6孔板中，同时加入实验确定的浓度G418，随后每2d更换一次培养基并维持G418筛选直至单细胞抗性克隆的出现。分别挑选单一抗性克隆至96孔板，待其逐渐增殖后转入24孔板中继续传代培养。

3)荧光素酶活性鉴定阳性克隆

单一抗性克隆传代至第五代时用LuciferaseAs-sayAystem检测荧光素酶活性。检测时，各克隆按1×105个/孔接种到24孔板，24h后细胞裂解液裂解12000rpm，4℃离心10min，收集裂解物，取上清10μl加入96孔白板中，向每孔加入50μl荧光素酶96microplateluminometer连续读底物，停留2s后，取10s的荧光值（RLU），每个克隆设3个复孔，保留RLU值高的细胞克隆继续传代培养，再过5代后进行荧光素酶活性检测。保留RLU值维持较高的克隆直至第30代，荧光素酶活性最高的几个克隆MCF-7-luc即为阳性克隆.

各不同数量细胞克隆的荧光值检测7-luc阳性克隆细胞按细胞数将筛出的MCF-4×104、2×104、1×104、5000、2500、1250、625、312和156分别接种到96孔黑板中，另外一组仅有细胞，一组仅有培养基作对照，设置2个复孔，常规培去上清并用PBS洗两次，每孔加入100μl养24h后，Luciferin使其终浓度为150μg/ml，PBS，再加入D-立即用活体成像系统检测，分析发光强度与细胞数之间的相关性。

4)细胞生长曲线绘制

MCF7-luc细胞和作为对照取表达荧光素酶的MCF-7细胞，接种于24孔板，接种密度为2×104/孔。细胞接种后1～7d，每天胰蛋白酶消化其中3孔细胞，用细胞计数仪测定细胞数。以细胞生长天数为横坐标，细胞数目为纵坐标，分别绘制两种细胞生长曲线。

二．动物模型

BLAB/c裸鼠皮下移植瘤模型的建立BLAB/cnu/nu裸鼠，4～5周龄，体重（15±2）g，雌雄各3只。取对数生长期的MCF-7用PBS重悬为2．5×10/ml悬液，每只裸鼠左右背侧近腋部皮下接种100μl，共接种6只。接种后第5d采用德国BERTHOLD公司的活体成像系统检测信号强度。以后每5d观测一连续观测30d。观测前每只裸鼠戊巴比妥钠麻醉（计量为：35mg/kg体重），按150mg/kg体重的量腹腔注射luciferin（invivograde），10min后，进行活体成像观察皮下肿瘤的生长情况，定量分析各时间点的荧光值。绘制肿瘤皮下生长曲线.

MCF-7-luc细胞裸鼠皮下移植瘤的病理形态学观察

MCF-7-luc细胞裸鼠皮下接种后25d，脱颈处死小鼠，取肿瘤组织，制成石蜡切片，切片厚度为3μm，经HE染色后观察细胞的病理形态学。

活体动物成像技术是近期发展起来的一种新型稳定可靠,是检测动物体内分子及细胞事件的影像检测技术，强有力手段。利用生物发光成像（BLI）可以对活体病灶的大小进行无损伤直观准确检测。