最近,笔者在检测某药物(复合物碱(M)+酸(N))中的残留溶剂(三氟乙酸)时发现,单独进三氟乙酸对照品是一个峰,进系统适用性溶液(三氟乙酸+样品)时发现三氟乙酸的色谱峰分叉,考虑是样品原因引起的(主成分的色谱峰已经是平顶峰)。
其实验条件如下:流动相(A)0.07%磷酸(PH3.0),流动相(B)甲醇;洗脱梯度:0-6min,100%A;6.01-20min,90%-50%A;20.01-30min,100%A;色谱柱:Ultimate AQ-C18;检测波长:210nm;柱温30℃;进样量20µl;三氟乙酸储备液为1.5mg/ml,三氟乙酸对照溶液0.15mg/ml;系统适用性溶液:供试品0.2g,先用纯化水溶解,再加三氟乙酸储备液,然后定容至20ml。
1、调查不同样品量对三氟乙酸色谱峰的影响
实验过程:分别取样品约0.02g、0.05g、0.1g、0.2g置于20ml容量瓶中,加适量纯化水溶解,各加三氟乙酸储备液2ml,然后分别定容至刻度,进样分析(色谱条件同上),结果如下图。
从图1中可以看出,当加入样品的量为0.1g时,三氟乙酸色谱峰的峰形已经略有变化(峰变宽且略有拖尾);当加入样品的量为0.2g时,三氟乙酸的色谱峰分叉。
一般来说,只要样品样品中各个成分的重量不要过多(通常对于4.6mm内径的柱子进样量<500µg),每个峰带在柱子内的移动就不会受样品中其它峰带的影响。因此,样品中单个化合物的重量,往往决定了化合物是否会超载,峰形是否改变,而与样品总量无关。
当加入样品的量为0.1g时,,主成分的色谱峰为平顶峰,虽然色谱峰超载,但并没有影响其它组份的分离;当加入样品的量为0.2g时,三氟乙酸色谱峰的分离受到影响。实质上是样品和稀释溶剂组成三氟乙酸的稀释剂,供试品与溶剂组成的溶液的PH与流动相不同,也就是三氟乙酸在稀释剂中的电离状态与流动相中的状态不同,供试品浓度越大,影响越大。因此可以减少样品量来解决这个问题。
2、考察不同稀释剂对三氟乙酸色谱峰的影响
实验过程:取样品约0.2g置于20ml容量瓶中,分别加适量纯化水、PH3.0流动相、0.1%磷酸溶解,各加三氟乙酸储备液2ml,然后分别定容至刻度,进样分析(色谱条件同上),结果如下图。
从图中可以看出,在加入样品量为0.2g时,通过调节稀释剂对三氟乙酸色谱峰的峰形有所改善。
通常情况下,样品溶剂比流动相弱,进样体积不会对峰宽和分离度造成负面影响;相反,样品溶剂比流动相强时,往往会使色谱图中较早流出的色谱峰扭曲变形或峰宽加宽。用流动相作为稀释剂,得到的峰形相对较好,是因为三氟乙酸在稀释剂和流动相中的电离状态较为一致;0.1%磷酸作为稀释剂,三氟乙酸部分质子化,在稀释剂中的状态与流动相中的状态不一致。
3、考察不同流动相PH对三氟乙酸色谱峰的影响
实验过程:流动相(A)为0.07%磷酸,调节PH为6.0(三乙胺调节);取样品约0.2g置于20ml容量瓶中,加适量流动相溶解,各加三氟乙酸储备液2ml,然后分别定容至刻度,进样分析(色谱条件同上),结果如下图。
从图中可以看出,通过调整流动相的PH可以明显改善三氟乙酸色谱峰的峰形,主要原因是通过增加流动相的PH减弱主成分对三氟乙酸的影响,增加了化合物与色谱柱之间的作用力,从而增强了色谱柱的筛选作用。其主要原因是流动相中的三乙胺与色谱柱上的固定相作用,然后再与三氟乙酸作用,形成离子对作用,所以图中三氟乙酸色谱峰保留时间增长,但基线较差,是因为离子对效应,平衡时间短。
4、将0.07%磷酸改为20mM磷酸二氢钾(PH6.0)
实验过程:流动相(A)为20mM磷酸二氢钾,调节PH为6.0(氨水调节);取样品约0.2g置于20ml容量瓶中,加适量流动相溶解,各加三氟乙酸储备液2ml,然后分别定容至刻度,进样分析(色谱条件同上),结果如下图。
从图中可以看出,将0.07%磷酸(PH6.0)改为20mM磷酸二氢钾(PH6.0)后,三氟乙酸色谱峰仍然分叉(样品与对照),主要原因是流动相缓冲能力不足引起的。
5、将0.07%磷酸改为20mM磷酸二氢钾(PH3.0)
实验过程:流动相(A)为20mM磷酸二氢钾,调节PH为3.0(氨水调节);取样品约0.2g置于20ml容量瓶中,加适量流动相溶解,各加三氟乙酸储备液2ml,然后分别定容至刻度,进样分析(色谱条件同上),结果如下图。
从图中可以看出,将0.07%磷酸(PH6.0)改为20mM磷酸二氢钾(PH3.0)后,三氟乙酸色谱峰仍然分叉(样品与对照),主要原因是流动相缓冲能力不足引起的。
综上所述,流动相的PH和稀释剂可以显著影响色谱峰的峰形,因此在平时实验中要注意稀释剂效应和流动相的缓冲容量。
总结
(1)在整个实验过程中,样品始终具有溶剂效应;
(2)调整流动相的PH可以改变样品进样量,并且影响色谱峰的峰形;
(3)使用流动相作为稀释剂可以改善色谱峰的峰形。
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