肝细胞癌（HCC）是一种非常普遍的癌症，发病率逐年增加且死亡率高。十多年来，具有抗血管生成特性的酪氨酸激酶抑制剂（TKI），如索拉非尼，一直是全身治疗肝细胞癌的标准选择。近期，使用免疫检查点抑制剂获得了令人鼓舞的成果，抗血管生成药物和免疫检查点抑制剂阿替利珠单抗+贝伐珠单抗的组合已被采用为治疗晚期HCC的新标准。因此，了解两种药物类别和联合治疗的作用方式、临床疗效和生物标志物显得至关重要。
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抗血管生成药
血管生成是一个由促血管生成因子和抗血管生成因子介导的复杂过程。原血管生成因子包括VEGF家族、血管生成素、表皮生长因子和基本成纤维细胞生长因子。此外，炎症分子如IL-6和IL-8也在血管生成中发挥作用。过量的促血管生成因子会刺激肿瘤血管生成，因此阻断血管生成的目的是切断肿瘤的血液供应，最终导致肿瘤病灶缺氧坏死。
目前在HCC领域批准的抗血管生成药物包括阻断VEGF配体的抗体(贝伐珠单抗)，VEGF受体2 (雷莫西尤单抗)以及阻断VEGF受体激酶活性的多靶点TKIs (索拉非尼等)。
抗血管生成药的生物标志物
预后生物标志物能提供一般结局的信息，而预测性生物标志物能够识别将从特定治疗中受益的患者亚组。迄今为止，AFP是HCC中唯一经过验证的预测生物标志物，例如高AFP水平（>400ng/mL）可预测二线治疗中雷莫西尤单抗的反应。除预测作用外，AFP还具有明确的预后价值，并被纳入评分量表，用作研究中的纳入或排除标准。
此外，转录组生物标志物是最有希望的未来临床应用。反映血管生成增强的基因标记与一线VEGFR-TKIs的改善结果相关。这在一些回顾性研究中得到了证实，而且在比较IO-VEGF靶向治疗和VEGFR-TKI单药治疗的大型3期试验的生物标志物分析中也得到了证实。
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免疫检查点抑制剂
免疫检查点分子是调节免疫系统激活状态的适应性免疫反应的关键元素。PD-1和CTLA-4是两种主要的抑制性免疫检查点分子，它们调节免疫系统的激活，以避免有害的过度刺激。PD-1与其配体PD-L1之间的抑制相互作用导致T细胞失活，而T细胞上CTLA-4表达的增加抑制了免疫突触中有效抗原的呈递，并加强了调节性T细胞的免疫抑制功能。癌细胞能够劫持这些内置的防御机制，抑制抗肿瘤免疫反应，发生免疫逃避并促进肿瘤的进一步进展。
针对这些免疫检查点分子的治疗已经彻底改变了抗癌免疫治疗方式，其中最广泛使用的是以PD-1/PD-L1和CTLA-4为靶点的检查点抑制剂。CTLA-4抑制剂通过抑制CTLA-4分子，能使T细胞大量增殖，并恢复TME中刺激信号和调节信号之间的平衡。相反，抗PD-1/PD-L1免疫治疗打破了PD-1和PD-L1之间的抑制相互作用，从而重新激活肿瘤特异性细胞毒性T细胞（CLT细胞）。
肝脏是第一线免疫器官，健康的肝脏高度充满了先天和适应性免疫细胞，从而创造了一个全面的免疫耐受微环境。然而，在慢性炎症的情况下，肝脏中免疫细胞的组成可能发生巨大变化，扰乱刺激信号和抑制信号之间的微妙平衡，最终导致进行性肝损伤，最终恶性转化并发展为HCC。
微环境的改变是HCC发病机制和预后的关键。独特的病毒性和非病毒性病因与独特的TME相关。TME HCC的免疫特征可以被描述为免疫活性肿瘤，其倾向于对ICI反应良好，或免疫排斥肿瘤，被认为对ICI具有抗性。
尽管检查点抑制剂已经彻底改变了包括HCC在内的几种实体肿瘤的治疗，但只有大约15-20%的HCC患者对ICI单药治疗表现出客观反应。
PD-1/PD-L1抑制剂方面，纳武利尤单抗和帕博利珠单抗已被FDA批准作为HCC的二线治疗；此外，替雷利珠单抗在OS方面不劣于索拉非尼。CTLA-4抑制剂方面，大多数用作HCC的联合治疗，尚无CTLA-4抑制剂被批准作为HCC单药治疗。免疫联合疗法方面，度伐利尤单抗（抗PD-L1）+tremelimumab（抗CTLA-4）联合使用可作为阿替利珠单抗+贝伐珠单抗的替代疗法。而纳武利尤单抗（抗PD-1）和伊匹木单抗（抗CTLA-4）的组合，则作为索拉非尼之后的二线治疗被FDA批准。
免疫检查点抑制剂的生物标志物
目前临床实践中没有ICI反应的预测生物标志物。研究最多的潜在生物标志物是PD-L1在肿瘤细胞或免疫细胞中的表达、TMB、dMMR和Wnt/β-catenin通路的激活。考虑到对检查点抑制剂的反应的复杂性，比起单个生物标志物，一个包含多个因素的预测模型将更有可能估计对ICI的反应概率。
PD-L1的表达与肿瘤侵袭性和不良预后相关。尽管PD-L1在免疫组织化学和ICI反应方面的相关性已被证实，并且其被批准的诊断试验作为治疗多种癌症的生物标志物，但它并不是HCC ICI反应的有效工具。肿瘤比例分数，即PD-L1部分或完全膜染色的活肿瘤细胞相对于样品中所有活肿瘤细胞的百分比（如果≥1%，则为阳性），不能预测KEYNOTE-224中对帕博利珠单抗的反应。在Checkmate 459研究中，与PD-L1表达低于1%的患者相比，肿瘤细胞PD-L1表达为1%或更高的患者中，纳武利尤单抗组应答者的比例也没有显著提高。因此，肿瘤细胞PD-L1表达不能预测OS或PFS。
激活的Wnt/β-catenin信号与免疫排斥相关，从而导致肝癌的免疫治疗抵抗。编码β-catenin的CTNNB1突变发生在三分之一的HCC患者中。在CTNNB1突变的小鼠和人类肿瘤样品中，观察到CCL5的减少，CCL5是一种处理CD103+树突状细胞和抗原特异性CD8+T细胞募集的趋化因子。因此，激活的Wnt/β-catenin信号传导导致树突状细胞的募集受损，这对于通过处理抗原材料，将其呈现在其表面和激活的T细胞来建立有效的抗肿瘤免疫应答至关重要。
肿瘤突变负荷(TMB)，定义为非同义单核苷酸变异的数量，可能会增加ICI反应的可能性。然而，在HCC中，TMB普遍较低，其作为ICI预测标志物的作用尚未得到现有数据的支持。
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阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗
PD-L1抑制和VEGF抑制联合应用显著提高了HCC的全身治疗效果。联合治疗成功的原因无疑与HCC TME的免疫抑制状态和血管生成的调节能力有关。
除了其在血管生成中的典型作用外，VEGF还通过以下多种主要机制直接或间接地驱动TME中的免疫抑制。直接促进具有免疫抑制功能的MDSCs、Tregs和M2-TAMs的增殖，抑制具有免疫激活功能的CTL和mDCs的增殖或成熟。因此，VEGF创造了一个免疫沉默的肿瘤微环境。贝伐珠单抗可以抵消这些作用，将免疫抑制转向免疫活性肿瘤微环境，从而增强阿替利珠单抗的疗效。
由于肝脏是一个免疫耐受的器官，而HCC通常起源于导致免疫衰竭的慢性肝脏炎症，HCC中的癌细胞有利于免疫耐受的TME，这影响了免疫治疗的有效性。结合VEGF抑制和PD-L1抑制的目的是通过将免疫抑制的TME改变为更有利于免疫的TME来增强抗癌免疫。癌症免疫被描述为一个七步循环过程，称为癌症免疫周期(CIC)。它包含以下三个阶段：
1. 通过树突状细胞(DC)成熟和功能上调抗原呈递(CIC步骤1-3)
T细胞启动和激活CTL依赖于抗原呈递至淋巴结中的T细胞，其中树突状细胞发挥了关键作用。肿瘤相关DC存在于不成熟状态，需要经过成熟才能发挥功能。这种成熟的特征是上调MHC I和II以及其他共刺激分子，是在NF-ĸB的调控下进行的。VEGF可通过VEGFR1抑制NF-ĸB-pathway，导致DC成熟受损，进而导致成熟DC数量减少。贝伐珠单抗治疗已被证明可增加癌症患者外周血中成熟DC的数量。此外，DC也受PD-L1的调控，VEGF可上调DC上的PD-1和PD-L1，导致功能抑制。另一方面，抗PD-L1治疗可以改善DC功能并增强T细胞启动。
2. T细胞增殖、转运和浸润上调(CIC步骤4-5)
为了攻击癌细胞，启动的CTL必须从淋巴结移动到TME，进入肿瘤血管系统，附着在内皮上，并在细胞壁上迁移。由于肿瘤血管的渗漏和结构混乱，T细胞更难进入。VEGF还通过降低肿瘤和免疫细胞血管内皮上的粘附分子的表达来损害T细胞的粘附。此外，VEGF-A通过诱导内皮细胞上的Fas配体抗原进行协同作用，内皮细胞具有诱导CTL而非Tregs凋亡的能力。最后，VEGF可通过上调PD-1导致T细胞衰竭。从理论上讲，抗VEGF治疗可以阻止所有这些作用，从而改善T细胞流向肿瘤血管的通量，改善通过内皮的粘附和迁移，并改善CTL。
3. 削弱免疫抑制细胞的招募和增殖(CIC步骤6-7)
VEGF可增强TME中的一组免疫抑制细胞。髓细胞衍生抑制细胞（MDSCs）是由VEGF上调的粒细胞和单核细胞亚群组成的异质细胞群，可抑制CTL的增殖并促进Treg的生长。此外，免疫抑制细胞，如MDSCs，也可以驱动血管生成，从而形成免疫抑制的恶性循环。之后，Tregs的募集和增殖直接由VEGF介导。最后，VEGF促进M2样肿瘤相关巨噬细胞，以支持M1表型。因此，抗VEGF将使具有MDSCs和Treg的免疫沉默的TME向具有更高M1:M2比率和CTL的更具免疫能力的TME转变。
阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗的生物标志物
最近的一项研究整合了在GO30140 1b期和IMbrave150 3期试验中使用阿替利珠单抗和贝伐珠单抗治疗的358名患者的肿瘤活检的转录组学、遗传学和免疫组织化学数据，以确定潜在的生物标志物和反应机制。总体而言，作者证实了免疫细胞特征对预测接受免疫治疗的肝癌患者预后的预测能力。阿替利珠单抗/贝伐珠单抗的应答者具有更高的与适应性和先天免疫系统相关的基因表达，以及CD274（PD-L1 mRNA）的表达和效应T细胞的特征。此外，免疫组织化学上，应答者肿瘤的特点是CD8+T细胞浸润更高，PD-L1表达更高。与索拉非尼相比，在表达GPC3（Glypican-3）和AFP水平较低的肿瘤中，阿替利珠单抗/贝伐珠单抗的反应也较高，这些肿瘤是CTNNB1野生型，并携带TERT突变。
由于在GO30140 1b期试验中存在阿替利珠单抗单药治疗组，作者还可以探索贝伐珠单抗与阿替利珠单抗的协同作用的临床证据。虽然没有发现与两个治疗组之间的反应相关的单个基因或途径。然而，通过基因表达谱的去卷积，包括CD8+T细胞、Tregs和巨噬细胞在内的免疫亚群与贝伐珠单抗增加的临床益处相关。总的来说，本研究抑制了由于加入贝伐珠单抗而导致的成熟DC和CD8+T细胞数量增加、MDSC减少和Tregs增殖抑制。
总结
近年来，接受系统治疗的肝癌患者的预后取得了显著进展，最近的临床试验报告了使用新的免疫疗法组合约20个月的OS。通过彻底揭示新联合治疗的作用机制，以及识别可预测疗效的标记物，可以进一步完善这些进展。最终，这些知识将有助于提高HCC一线系统治疗的个性化。
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