更新一代的CAR-NK细胞治疗能否更安全、更方便且疗效更好？已有生存期超40月

正文

随着科技进步与时代发展，肿瘤生物医药领域迎来发展的“黄金期”，尤其是基因与细胞治疗，已经成为肿瘤学中的一个重要亚专科和发展方向。今天为大家分享CAR-NK相关内容。

NK细胞：自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）是机体重要的免疫细胞，其占人体所有循环淋巴细胞的15%，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。

NK细胞表面有众多受体，NK细胞的脱粒、细胞因子释放和细胞杀伤功能受其表面多种受体的调节。如图3，这些受体主要分为NK细胞抑制受体（KIR）、活化受体（KAR）和协同刺激受体，当NK细胞与健康细胞接触时，健康细胞的的MHC-I分子会激活NK细胞的KIR，避免了NK细胞的激活对健康细胞的杀伤作用。但是，当NK细胞接触到一些感染细胞或肿瘤细胞时，KAR和协同刺激受体会识别其表面的配体，介导NK细胞的激活，KIR家族中也存在一些受体被划分为激活型受体，因为这些受体可以识别病原体相关的配体或者MHC-I分子的抗原肽谱改变。总而言之NK细胞是人体内抗癌防线不可或缺的组成部分，直接参与人体对肿瘤细胞的杀伤过程。

NK细胞的生理功能

NK细胞发挥细胞杀伤作用的机制主要包括：

①下调MHC-I分子的肿瘤细胞被检测为“丢失自我（Missing-self）”，NK细胞分泌胞质粒，其中包有穿孔素（Perforin）和颗粒酶（Granzyme）等细胞毒性颗粒；

②肿瘤细胞激活NK细胞受体，NK细胞表达肿瘤坏死因子，如凋亡相关因子配体（FasL）和肿瘤坏死因子相关诱导配体（TRAIL）等，诱导肿瘤细胞的凋亡；

③肿瘤抗原特异性抗体Fc段与CD16（FcγRIII）结合，引起抗体依赖性NK细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）。

NK细胞（黄色）正在攻击肿瘤细胞（红色）

NK细胞的功能，包括脱颗粒、细胞因子释放和细胞毒性，是由抑制性受体（主要是抑制性杀伤性Ig样受体KIRs和异二聚体C型凝集素受体NKG2A）和激活性受体（主要是NCRs、NKp46、NKp30、NKp44和NKG2D），识别其细胞靶上的配体，从而使NK细胞进入“沉默”状态或“激活”状态来实现。

嵌合抗原受体——CAR是一种基因工程技术制造的人工受体分子，它可以赋予免疫效应细胞（如T淋巴细胞、NK细胞）针对某个靶点抗原表位的特异性，从而增强T淋巴细胞或NK细胞识别抗原信号与活化的功能。

CAR结构通常是由细胞外抗原识别区、穿膜区和细胞内信号转导区组成的融合蛋白。细胞外抗原识别区通常是单链抗体（scFv），可识别肿瘤细胞上的特异性抗原。根据细胞内信号域的不同，可以将CAR结构分不同的代数。

第一代CAR结构：依赖于单一的细胞内信号域；

第二、三代CAR结构：携带有一个或多个额外的共刺激分子，显著增强了细胞内的活化信号；

第四代CAR结构:被称为装甲CAR，第四代结构采用了一种截然不同的方法，通过加入分子有效载荷，从而赋予CAR修饰的免疫细胞在任何物理免疫细胞受体中都找不到的额外特征和功能。

CAR结构的演化

CAR-NK细胞疗法:经过CAR结构修饰后的NK细胞，能够高效的识别肿瘤细胞，并通过释放杀伤介质、诱导靶细胞凋亡等多种手段杀伤肿瘤细胞。在临床前和临床试验中，科学家们越来越关注更具成本效益、安全、有效的“现货型”细胞疗法。

目前研究中使用的NK细胞主要有四种来源：供体或自体的外周血单核细胞（PBMC）、NK细胞系培养、脐带血（UCB）、人胚胎干细胞（hESC）/诱导多能干细胞（hiPSC）.

CAR-NK细胞疗法在肿瘤治疗领域进展

2024年1月18日，德克萨斯大学MD安德森癌症中心的研究人员在 Nature Medicine 研究论文。

该研究是一项1/2期临床试验，纳入了37名复发或难治性CD19阳性的B细胞恶性肿瘤患者参与，研究旨在评价表达了抗CD19 CAR和IL-15的脐带血来源的NK细胞疗法（CAR19/IL-15 NK）的安全性和有效性。该临床试验的主要目标是安全性和有效性，定义为治疗第30天时的总缓解率（OR），次要目标包括第100天时的总缓解率（OR）、无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）和CAR19/IL-15 NK细胞的持久性。

结果显示，在第30天和100天时，接受治疗的患者的总缓解率（OR）均为48.6%，一年无进展生存率为32%、总生存率为68% 。此外，该试验报告了良好的安全性，患者没有出现严重细胞因子风暴、神经毒性或移植物抗宿主病（GvHD）

此外，该研究还发现用来制造CAR NK细胞的异体脐带血捐赠者的选择标准至关重要，采集后24小时内就冷冻的脐带血单位（CBU）和那些有核红细胞含量低（≤8×107）的脐带血单位（CBU）与明显更好的治疗结果相关。从这些脐带血单位（CBU）制造的的CAR NK细胞在给予患者治疗后，一年无进展生存率高达69%，一年总生存率高达94%，而那些有核红细胞含量高或采集至冷冻间隔时间较长的脐带血单位（CBU）制造的CAR NK细胞，在给予患者治疗后，一年无进展生存率和总生存率分别为5%和48%。

2024年2月，Front Immunol杂志上发表了一篇题为“CAR-NK cells for cancer immunotherapy: recent advances and future directions.”的综述文章，深入研究了肿瘤微环境中NK细胞动力学的基本特征和最新突破，评估了CAR-NK细胞治疗策略相关的潜在应用和挑战。

2020年2月《新英格兰医学杂志》，发表使用CAR转导的自然杀伤细胞（CAR-NK细胞）治疗CD19阳性的淋巴瘤的文章。

研究纳入了11名淋巴瘤患者，通过连续3日接受每日氟达拉滨（剂量为30 mg/m2体表面积）和环磷酰胺（剂量为300mg/m2），进行淋巴细胞清除性化疗后，单次输注下列三种剂量之一的CAR-NK细胞(1×105，1×106或1×107 CAR-NK细胞/公斤体重）。其中，前9例患者接受了与患者组织相容性抗原（HLA）基因型部分匹配的CAR-NK（在HLA位点A、B和DRβ1，6种HLA分子中的4种匹配），第10名和第11名患者未进行HLA配型。完成第30日肿瘤评估后，可根据医生的意见给予疾病缓解后的治疗。

结果显示，中位随访13.8个月（2.8～20.0）时，8例患者（73%）获得客观缓解，其中7例（3例慢性淋巴细胞白血病[CLL]患者和4例淋巴瘤患者）达到完全缓解。通过患者血液检测结果表明，CAR-NK细胞扩增最早在输入后3日即可观察到，无论剂量大小，CAR-NK细胞至少持续存在12个月。注射后第14天及更长时间的观察显示，CAR-NK细胞拷贝数与给药细胞剂量无显著相关，提示CAR-NK细胞在体内增值导致其持续存在。同时，与治疗后无疗效的患者相比，有缓解的患者有明显较高水平的早期CAR-NK细胞扩增和细胞峰值数。

安全性方面：CAR-NK细胞安全性良好。没有患者由于与CAR-NK细胞治疗相关的不良事件。输入CAR-NK细胞后，所有患者均未出现细胞因子释放综合征、神经毒性或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症的症状。此外，虽然患者与其使用的CAR-NK的HLA不匹配，但我们未观察到任何移植物抗宿主病（GvHD）。所有患者均发生了短暂的、可逆的血液学毒性事件，主要与清除淋巴细胞的化疗相关。

2023年北京消化肿瘤国际高峰论坛暨中国胃肠肿瘤临床研究协作组（CGOG）年会上，田志刚院士以“基于NK细胞的肿瘤免疫治疗”为题进行专题报告。通过NK细胞疗法的进展，可以窥见未来肿瘤细胞治疗的广阔空间，见微知著。

田院士表示：CAR-NK细胞同时高表达多种天然NKRs，在CAR识别肿瘤的基础上，其他识别受体继续识别肿瘤，表达阴性的肿瘤细胞。且NK细胞还可以与其他细胞配合，起到抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）效应。此外，NK细胞疗法还存在许多未被挖掘的潜能。可记忆性感应肿瘤微环境的NK细胞、可负载各种抗体的“武装NK细胞”等均是NK细胞疗法的研发方向。未来更智能化的NK细胞研发可以通过编码基因，控制NK细胞发挥作用的部位、时间等，实现更精准杀灭肿瘤，更小的毒副作用。

田院士团队的NK细胞疗法已有了小范围的试验。在晚期肿瘤患者中，也可以看到较长的生存期延长。

NK010的IIT临床试验中纳入预计生存期2-6个月的铂耐药晚期卵巢癌患者，设计了3+3+3的剂量爬坡。从结果来看，中剂量、高剂量的NK010细胞输注延长了患者生存期。

该研究中，一位卵巢癌患者入组时已经全身多发转移，腹水。经过13次NK细胞治疗，生存期已经＞40个月。

CAR-NK细胞疗法已经在胶质母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、肝癌等多个癌症治疗领域取得进展。

CAR-NK细胞疗法中NK细胞的主要来源为NK-92细胞系（占比43%），其次分别为PB-NKs （21%）、iPSCs（17%）和UCB-NKs（13%）。相较而言，CAR-NK细胞疗法实体瘤和血液瘤治疗的占比接近对半开（45% VS 55%），其中实体瘤主要针对的胰腺癌（26%）、非小细胞肺癌（11%）、肝癌（11%）、MCC（8%）、结直肠癌（7%）、前列腺癌（7%）、乳腺癌（7%）和头颈部肿瘤（7%）。

2021年12月CAR-NK细胞疗法临床试验数据统计

国内首个“现货型”CAR-NK临床试验获药监局批准：2021年11月11日，国家药监局药品审评中心通过了一款我国自主研发的针对“晚期上皮性卵巢癌治疗的靶向间皮素（Mesothelin,MSLN)嵌合抗原受体NK细胞（CAR-NK）注射液”（简称：CAR-NK注射液）的临床试验申请。

“现货型”CAR-NK疗法向“癌王”胰腺癌发起进攻：近年来，随着医学临床研究的深入，人们发现大约60%~80%的胰腺癌表达前列腺干细胞抗原（PSCA），CytoImmune与City of Hope合作开发了一种针对PSCA的嵌合抗原受体（CAR），用于转导到人类自然杀伤（NK）细胞中，还敲入了分泌性IL-15，维持NK细胞的存活。

研究团队采用CYTO NK-203疗法（一种现成的同种异体 CAR-NK 细胞疗法，源自脐带血，可以提高NK细胞安全性和杀伤功效的一种潜在的疗法），在人类转移性胰腺癌小鼠模型中发现以PSCA为靶点的“现成”的CAR-NK疗法能够显著抑制胰腺癌：在小鼠体内持续存活超过90天，显著延长其寿命，且未显示出治疗相关毒性。

2022年1月10日，Fate Therapeutics公司宣布，美国FDA已批准FT536的新药临床研究（IND）申请。FT536是一款经过多重工程修饰、诱导多能干细胞（iPSC）衍生的 “即用型”CAR-NK细胞疗法，FT536表达一种特异性靶向I类主要组织相容性复合体（MHC）相关蛋白A和B(MICA/MICB)α3结构域的新型CAR。MICA和MICB属于应激蛋白，在许多实体瘤上高水平表达。此次FT536获批临床研究，表明MICA和MICB正在成为广泛的实体瘤中令人兴奋的癌症免疫疗法靶标。关于此款疗法的多中心I期临床试验开展的肿瘤类型包括：晚期非小细胞肺癌、结直肠癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。

2019年我国研究学者发表靶向NKG2D的CAR-NK细胞治疗结直肠癌患者研究，其初步疗效值得肯定。3例转移性结直肠癌患者，前两例患者腹腔输注低剂量 CAR-NK 细胞后，可观察看腹水生成量减慢以及腹水样本中肿瘤细胞的数量急剧减少；第三例肝转移瘤患者采用超声引导下瘤内经皮注射和腹腔内灌注方式输注 CAR-NK细胞后，多普勒超声可见肝部肿瘤快速缩小，(PET-CT）提示经治疗的肝病灶为完全代谢反应。3 例患者在治疗过程中均无出现3级或以上的不良事件。

波兰罗兹医科大学研究者在国际分子科学杂志（International journal of molecular sciences）发表了关于CAR-NK细胞治疗实体瘤的综述，该综述中提到一项CAR-NK治疗胰腺导管腺癌伴肝转移的案例：一名46岁男性胰腺癌患者被诊断为胰腺导管腺癌（PDAC）伴肝转移（T4N1M1，Ⅳ期），该患者接受ROBO-1特异性CAR-NK细胞输注治疗。治疗前，胰腺病变伴有淋巴浸润和肝脏多处高代谢病变，每周输注ROBO-1导向的CAR-NK细胞和瘤内注射（肝转移）治疗。5个月内胰腺病变和肝转移得到控制。

a、b治疗前，胰腺病变；c、d5个月内得到控制

此外，NK细胞疗法有多种组合治疗方式，旨在提升NK细胞存活率和活化率、驱动NK细胞向肿瘤部位迁移、增强免疫抑制微环境抗性、发挥ADCC药物治疗能力以及通过靶向免疫调节从而增强细胞毒性功能。包括：NK细胞引发剂、过继细胞疗法、抗体、酪氨酸激酶抑制剂、小分子抑制剂、引发剂和NK细胞结合剂等。

与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞有显著优势

①更好的安全性。在临床研究中CAR-NK疗法的细胞安全性已经得到证实：NK细胞主要分泌细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）和粒细胞-巨噬细胞刺激因子（GM-CSF），且在体内数周内不会扩增，因此降低细胞因子释放综合症（CRS）发生的风险。

②多种激活机制。CAR-NK细胞可通过CAR依赖和NK细胞受体依赖性途径抑制癌细胞，从而消除肿瘤抗原阳性癌细胞或表达NK细胞受体配体的癌细胞。临床试验表明，CAR-T细胞不能消除高度异质性的癌细胞，但是CAR-NK细胞能够有效地杀死长期治疗后可能改变其表型的残留肿瘤细胞。

③可生产“现货产品”（off-the-shelf product）。NK细胞在临床样本中非常丰富，可以从外周血（PB）、脐带血（UCB）、人类胚胎干细胞（HESC）、诱导多能干细胞（IPSC）甚至NK-92细胞系中产生，进行体外培养和基因改造后的NK细胞有潜力应用于同种异体过继转移。

④可对CAR-NK细胞进行改造，使其靶向多种抗原，增加对实体瘤的浸润，克服耐药的肿瘤微环境，最终实现有效抗肿瘤反应。

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