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CHIP
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>《实验技术》
2020.12.17
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我们的公众号周一、三、五更新生命科学相关;周二、四、六杂谈。
研究蛋白与蛋白的相互作用的方法有拉下实验(pull-down)、coIP (immunoprecipitation, 免疫沉淀);
研究蛋白与RNA相互作用的方法有RIP(RNA结合蛋白免疫沉淀);
研究蛋白与DNA相互作用的方法有CHIP(染色质chromatin免疫共沉淀)。
以上几种研究方法共用一个原理——免疫沉淀。即,抗原蛋白A与B(蛋白、RNA、DNA)相互作用,使用bead结合抗体A,把抗原A沉淀下来,然后在沉淀中检测B的存在。
coIP和pull-down比较简单,直接用抗体B检测沉淀物即可,而RIP和CHIP则要用检测RNA和DNA的方法,测序或者PCR,今天介绍CHIP。
CHIP
什么蛋白与DNA相互作用?
(1)组蛋白,结合牢固,很好检测;
(2)转录因子,结合较松散,检测有难度;
(3)辅助转录因子,很难检测,检测位点经常被掩盖。
实验流程
CST有两款CHIP试剂盒,一种酶解法,一种超声法,主要的区别在于染色质片段化的处理过程,一种主要用酶,一种主要用超声;酶解法更稳定,适合小白,超声法,有经验者,结果更好。
预实验摸好条件后,严格按照protocol来,即可。
CHIP实验结果的影响因素
(1)样品
a,单组实验最少要有400万个细胞,DNA浓度可达到100ng左右;还有阴性、阳性对照两组;
b,甲醛处理时间要合适,不同细胞需要预实验摸索;
c,酶消化和超声处理,要使DNA处理到150-500bp最佳,预实验摸索,这部很关键。
(2)免疫沉淀过程
严格按照protocol,主要是抗体选择,说明可以做CHIP的抗体,如果是测序分析DNA,还要选择测序级别的抗体;浓度1:100-200一般为最佳;
(3)DNA分析
qPCR是很好的方法检测可能的结合位点;
引物设计主要在启动子区域,一般针对基因前100-500bp,设计涵盖启动子区域的多个引物,常用的软件有MEME、ECRBrowser。
CHIP用时较久,一般要3天,中间步骤复杂,得到好的结果不容易,需要反复预实验。
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