DDPCR技术
全称：微滴数字PCR
工作原理：利用微流体技术，形成纳升级微滴。阳性基因片段和阴性背景序列在微滴中随机分布。通过PCR扩增，在泊松分布原理的基础上，对结果进行判读。
优点：高度特异性、缩短检测时间、提高检测灵敏度
澳门的供水系统中有超过九成以上的原水是从珠海通过输水管流入澳门的水厂，水厂通过水处理工艺形成出厂水，最后通过管网输送至客户端。一旦供水系统受到环境污染，特别是致病性微生物导致的污染，将会引发水质问题和安全隐患。
澳门自来水公司于每个工作日在供水系统中采集水样，对水质进行检测和分析。对致病性微生物的检测方法采用的是国际上公认的标准检测方法，如膜滤法和多管发酵法等，这种方法存在检测周期长（几日～十几日）、操作繁琐（需要额外的确信实验）、易漏检受损菌、灵敏度低（1 colony forming unit (CFU) / 100 mL水样）和潜在生物危害等问题。尤其在发生水质突发变化或客户投诉等紧急情况时，已不能满足对水质快速诊断的要求。选择和建立更加安全、快速、简便、高度特异和灵敏度高的检测方法显得尤为重要和迫切。
微滴数字PCR (DDPCR， Bio-RadTM)作为最新一代的PCR技术，工作原理：采用先进的微流体技术，使每份20 µL的样本生成20 000个高度专一的纳升级微滴（图1），每个微滴都是一个独立的反应体系，阳性基因片段和阴性背景序列在微滴中随机分布，通过PCR扩增和荧光信号的累计读取阳性微滴的数目，再通过泊松分布原理计算出实际样本中的DNA绝对拷贝数浓度。这种采用绝对定量的方式进行样本分析的技术，不仅具有高度特异性，还可以大幅度缩短检测时间（约5 h），提高检测灵敏度，使定性与定量分析达到了一个全新的水平。
图1 纳升级微滴示意图
本研究采用DDPCR技术对澳门供水系统中的致病性微生物进行定量检测，以验证该技术在实际应用中的检测能力和检测效率。通过评估供水系统中的水质受污染程度，使水厂可以在最短时间内采取措施改善水质，减少不必要和不可预估的经济损失，为建立地区水污染早期应急机制起到带头示范作用，为水质预警管理做好技术储备。
以大肠菌群和嗜肺军团菌为主要研究对象，建立可对其准确定量的DDPCR检测方法。选择该研究对象的原因主要如下：
大肠菌群作为主要的肠源性致病菌，可通过粪便传播进入供水系统，我国和世界其他各国广泛采用大肠菌群作为饮用水受粪便污染的指标，评价其卫生质量。
由嗜肺军团菌引发的退伍军人症在澳门酒店和住宅区分别发生过数次，若进入供水系统，将会通过气溶胶的方式传播污染。
DDPCR反应体系为20µL：DDPCRTM预混液10µL；大肠菌群lacZ基因组DNA模板1 µL；正反向引物和探针（浓度待优化）；补水至20 µL。
将20µL反应液和70µL微滴生成油加入到微滴生成卡槽内，盖上胶垫，放入微滴生成仪中产生约40µL微滴。
随后将产生的微滴转移到96孔PCR板中，放在热循环仪中运行PCR。DDPCR扩增条件为：95°C预变性10min；94°C变性30s， 退火温度（待优化），1min, 循环40次；98°C酶失活10min。
DDPCR扩增完成后，将96孔PCR板放在微滴分析仪中读取荧光信号，通过QuantaSoft V1.7.4软件对结果进行分析。
引物和探针的选择
对水中大肠菌群用PCR检测技术，其难点在于引物设计困难，它要求设计的引物不仅能够检出不同种属的大肠菌群细菌，同时还能排除一些种属相近的非大肠菌群细菌。针对大肠菌群特有的lacZ基因，通过查找GenBank中收录的大肠菌群和非大肠菌群的lacZ基因序列，经过Blast比对，根据其特异性，最终确定引物和探针（表1）来建立DDPCR定量检测方法。
表1 大肠菌群DDPCR引物和探针序列
DDPCR检测方法建立
由于DDPCR方法对结果的判读是基于反应终点阅读到微滴的荧光信号强度，因此DDPCR方法中所有反应扩增后累积的荧光信号的强弱直接决定了该方法的准确性。在没有PCR抑制因子的情况下，荧光信号的累积与PCR扩增体系中的探针浓度、引物浓度以及扩增条件（如退火温度）等密切相关。可通过优化探针浓度、引物浓度、退火温度等反应条件来建立DDPCR检测方法。
试验表明，当探针浓度在0.5µmol/L时，荧光信号较集中，且阳性微滴和阴性微滴明显分成两簇，拖尾情况不明显。综合考虑荧光信号强度、稳定性和拖尾情况等因素，最终确定最优化探针浓度为0.5µmol/L。当引物浓度为0.2µmol/L时，虽然荧光信号值最低，但信号强度最为集中，且阳性微滴和阴性微滴可以明显分成两簇，拖尾情况不明显。综合考虑试剂成本等因素，最终确定最优化的引物浓度为0.2 µmol/L。
图2 DDPCR对大肠菌群定量检测方法中不同退火温度对扩增结果的影响
对本研究扩增条件中的退火温度进行系列梯度优化。当退火温度为56.3°C时，荧光信号值最高，信号较为集中，拖尾情况不明显，因此确定此温度为最优化的退火温度。
引物和探针的选择
通过查找GenBank中收录的嗜肺军团菌的mip基因序列，经过Blast比对，根据其特异性，最终确定本研究的引物和探针（表2）来建立DDPCR定量检测方法。
表2 嗜肺军团菌DDPCR引物和探针序列
DDPCR检测方法建立
同大肠菌群，本研究通过优化探针、引物和退火温度等条件来建立DDPCR定量检测嗜肺军团菌的方法。最终确定最优化的引物浓度为0.45 µmol/L，探针浓度为0.5 µmol/L，退火温度为59 °C。
针对不同的研究对象，在检测方法建立之后，分别通过对实际水样的检测分析来验证该检测方法的检测效率和检测能力。具体的典型案例检测分析如下。
从珠海和澳门共采集水样50份，其中珠海上游原水3份（分别采集于A水库、B水库和C水库），澳门水厂原水24份，澳门水塘原水5份，澳门水厂出厂水4份，澳门街点管网水14份。将所有水样提取DNA之后，用本研究建立好的DDPCR检测方法对其中的lacZ基因组DNA进行定量检测。
原水样本检测结果
检测结果表明，所有的原水水样（珠海上游和澳门原水，共32份）均有大肠菌群检出，且珠海上游的原水样本中检出的lacZ基因组DNA浓度（表3）均高于澳门原水水样中的浓度（表4），且A水库检出值最高，约为301.0 ± 21.2 copies/20µL DDPCR反应液。所有澳门原水水样中的大肠菌群lacZ基因组DNA浓度之间无显著差异（P=0.65）。
表3 珠海上游原水样本中的大肠菌群lacZ基因组DNA浓度（copies/20µL DDPCR反应液）
表4 澳门原水样本中的大肠菌群lacZ基因组DNA浓度（copies/20µL DDPCR反应液）
出厂水和街点管网水检测结果
用建立好的DDPCR检测方法对所有澳门的水厂出厂水和街点管网水水样提取后的大肠菌群lacZ基因组DNA进行定量检测。检测结果表明，所有的水样均未有大肠菌群检出。
澳门于2017年4月开始，连续发生数单有关嗜肺军团菌污染的事件。鉴于此，本研究团队与政府同时对发生事件附近的街点/大厦入屋前的水喉（图3）水样（共5份）进行采集，以便做结果比对。
图3 某大厦入屋前水喉取样点
将所有水样进行DNA提取之后，用建立好的DDPCR技术检测该水样是否受到嗜肺军团菌的污染。除了阴性对照（标记为A01和A02）和阳性对照（标记为B01和B02）设置2个重复检测之外，其余的实际样本（分别标记为C、D、E、F和G）均设置4个重复。
图4 DDPCR检测实际水样中的嗜肺军团菌结果图
结果表明，阳性参照可检出军团菌（156±3 copies/20µL）。阴性对照中没有检测到阳性微滴，可见扩增体系中没有被污染或非特异性扩增，表明该方法的特异性良好。所有采集的水样中均未检测出军团菌，证明这些水样没有受到军团菌污染。
政府对采集后的水样采用传统方法进行检测，培养周期较长，用时2周才得到检测结果，政府的检测结果与本研究的检测结果（用时5小时）一致。
对于水厂而言，出厂水的水质安全是保障社会居民健康安全的前提。若本研究可以得到推广应用，当遇到水质突发变化或客户投诉等紧急情况时，可以对水质进行快速诊断，第一时间采取措施来改善水质，同时可将诊断结果和水质改善情况公布于众，减少居民的恐慌，稳定民心，从而对维护社会和谐稳定起到积极作用。
若水质受污染，采用传统方法进行检测，因培养周期长，往往需要数十才可以检出结果。若此时再采取措施改善水质，将会带来不可预估和不必要的经济损失。本研究实施后，数小时后即可得到诊断结果，随后便可采取措施来改善水质，从而减少经济损失。
本研究从样本采集到结果获取，操作人员全程都不会接触到致病性微生物，且以对致病性微生物提取DNA致其失去活性，与传统检测方法相比，大幅度降低了潜在的生物危害，项目产生的废液采用专门的容器收集，按照废液处理规定，定期送到澳门垃圾焚化中心按照危废进行处理，避免废液直排对环境造成污染。因此，可保障操作人员、实验室内部及实验室外部周围环境的安全。
本研究建立的水中大肠菌群和军团菌的定量检测方法具有快速测定、灵敏度高和重复性良好等优点，达到了可以对这些致病性微生物同时进行定性检测与定量分析的目的。
对珠海和澳门的原水、水厂出厂水以及街点管网水的水样进行检测，进一步验证了该方法具有较高的实际检测效率和检测能力，为建立澳门地区水污染早期应急机制起到带头示范作用。
下一步将拓展研究对象，加大利用DDPCR方法定量检测水环境中致病性微生物的研究力度，为澳门日后的水质预警管理做好技术储备，以期为水质快速检测方法的建立提供参考。
姓名：马薇
职务：助理高级工程师
主要研究方向：微生物技术在环境中的应用，环境微生物检测及污染防治等
联系方式：emma.ma@macaowater.com
编辑：孙丽华
微信制作：王佳
审核：马薇（澳门自来水股份有限公司）
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