人表皮生长因子受体-2（简称HER2,又称ERBB2）基因突变, 为非小细胞肺癌（NSCLC）的少见驱动基因突变，约占整体NSCLC基因突变发生率的2%~4%。位于HER2基因激酶区第20号外显子上的12碱基框内插入突变 (p.A775_G776insYVMA, 等同于p.Y772_A775dup), 在蛋白质翻译时造成了原有第775号氨基酸残基丙氨酸(Ala)后四联氨基酸YVMA (Tyr-Val-Met-Ala，酪氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-丙氨酸)的多余复制插入， 而此类插入突变的发生率在HER2突变NSCLC占绝大部分比重，约为60%~70%。第20号外显子作为HER2基因酪氨酸激酶区的重要组成部分，其内发生的插入突变会引发HER2酪氨酸激酶的活化，并激活HER2下游的MEK-ERK-MAPK信号转导通路及PI3K-AKT-mTOR信号旁路，最终导致细胞的过度增殖和肿瘤形成。
目前，世界上已有大量研究表明以小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)为代表的靶向治疗在HER2突变型晚期NSCLC中疗效欠佳，其中最先研究的就是在EGFR突变中处于重要地位的第2代不可逆性EGFR/HER2抑制剂阿法替尼(Afatinib)。在HER2突变晚期NSCLC的TKI治疗领域，阿法替尼为代表的NICHE研究以失败告终，最终结果表明阿法替尼治疗HER2突变NSCLC的中位无进展生存期（mPFS）仅为15.9周 (约为3.7个月)，客观缓解率(ORR)低至7.7%。此外，中国的一项小样本多中心回顾性研究也表明阿法替尼治疗YVMA型插入突变NSCLC的mPFS仅为3.7个月，ORR为18.2% (2/11)。究其原因，早期的研究并未注意到HER2阳性NSCLC绝大部分突变亚型为A775_G776insYVMA插入突变，而此类插入突变无论在突变后的蛋白空间结构及药物结合活性上均为阿法替尼的耐药类型。
然而有意思的是，阿法替尼在随后HER2阳性NSCLC的研究中被发现对于非YVMA插入突变，疗效更高一筹。相关研究数据表明，阿法替尼治疗非YVMA插入突变，主要包括第776位氨基酸残基甘氨酸Gly位置上发生的2联氨基酸VC (Val-Cys, 缬氨酸-半胱氨酸) 缺失-插入取代突变 (p.G776delinsVC, G776＞VC)和第780号氨基酸残基脯氨酸Pro后发生的3联氨基酸GSP (Gly-Ser-Pro,甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸) 插入突变 (p.P780_Y781insGSP, 等同于p.G778_P780dup)，mPFS明显提高至7.6个月，远远高于YVMA型的1.2个月，且具有显著统计学差异(P＜0.001)；而同研究数据表明阿法替尼治疗14例YVMA插入突变，ORR为0。吡咯替尼(Pyrotinib) 在其II期多中心临床试验及PERAL真实世界研究中，显示出了对于HER2插入突变，尤其是YVMA亚型更高的ORR及PFS，目前作为一种很有潜力的抗HER2 TKI，正在进行二线与多西他赛头对头对比的国际III期研究，期待研究的最终结果。由于YVMA插入带来的独特突变蛋白空间构象及药物结合活性受损，新型泛ErbB TKI波奇替尼(Poziotinib) 在NSCLC中HER2领域的代表性ZENITH20-2队列研究中已显示出27%的ORR和5.5个月的mPFS, 而另一种仅在乏氧环境 (暗指肿瘤细胞)下才释放活性抗肿瘤成分的新型泛ErbB TKI Tarloxotinib (静脉输注)也在其代表性RAIN-701研究中治疗HER2突变NSCLC崭露头角。
如前所述，尽管某些研究发现阿法替尼治疗HER2少见插入亚型G776delinsVC具有一定疗效，但是研究样本数较小，仅为5例；且世界上也有其他一些研究表明阿法替尼治疗G776delinsVC疗效存在差别。故在此之前，世界上还尚未专题研究，比较G776delinsVC及其兄弟突变类型G776delinsVV、G776delinsLC的空间分子构象，以及其间是否存在突变蛋白与抗HER2 TKI结合活性的区别。临床肿瘤内科医生及HER2插入突变患者均只在个人经验及前人治疗总结基础上对此型突变的靶向治疗有着较模糊的认知，甚至不乏许多医患亦无法将NSCLC中的HER2插入突变类型进行有效的区别对待，从而施以经济、科学、有效的靶向治疗策略。
2022年3月，国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院王燕教授少见突变研究团队在药学领域前沿期刊《Frontiers in Pharmacology》(IF:5.810)发表了针对上述问题的系列研究，解决了大家临床上的疑惑。研究从G776delinsVC与YVMA插入突变蛋白结构的3D计算机模拟、突变蛋白与TKI的分子结合活性、突变细胞株的药物功能抑制以及中国真实世界G776delinsVC/VV/LC、insYVMA插入突变NSCLC患者四个层面入手，层层解析，在HER2少见插入突变亚型领域做出了系列工作。研究回顾性纳入了172例晚期NSCLC患者，其均携带A775_G776insYVMA、G776delinsVC、G776delinsVV或G776delinsLC插入突变的任意一种，且42例一线接受了靶向/抗血管治疗 (阿法替尼26例，吡咯替尼10例，波奇替尼1例，T-DM1 1例，第1代EGFR TKI 3例，安罗替尼1例)；二线TKI靶向治疗中，24例接受了阿法替尼，31例接受了吡咯替尼。
文章最终研究数据表明，阿法替尼一线治疗26例insYVMA或G776delinsVC的ORR为11.5%，mPFS为3.4个月；细分而言，对于21例YVMA插入突变，阿法替尼的ORR仅为9.5%，mPFS为3.2个月。5例G776delinsVC患者中, 阿法替尼ORR为20%，mPFS明显提高至7.1个月，与前述的世界相关研究结果相契合。阿法替尼二线应用时，整体24例患者中ORR为8.3%，mPFS为2.9个月；对于YVMA插入，17例患者无一例出现病情缓解 (ORR=0), mPFS仅为2.8个月。而对于7例G776delinsVC、G776delinsVV或G776delinsLC插入突变患者，阿法替尼ORR为2/7 (28.6%)，mPFS为4.3个月。
相对于阿法替尼，吡咯替尼在上述不同插入突变亚型中均表现出了较好的活性。吡咯替尼作为一线治疗时，样本量较小（仅为10例），整体mPFS为6.8个月，ORR为22.2% (2/9)。对于YVMA，其ORR为14.2%，mPFS为4.9个月。2例G776delinsVC突变患者中，1例呈现部分缓解(PR),相应的PFS为15.0个月；另1例虽然表现为疾病稳定(SD)，但截止末次随访，PFS亦有5.5个月，且未出现疾病进展。整体而言，相较于阿法替尼，吡咯替尼在一线治疗上，对于整体人群有着更长的PFS获益(中位, 6.8对比3.4个月, P< 0.010)。二线治疗时，吡咯替尼治疗YVMA突变患者的ORR为14.8%，mPFS为5.8个月。3例G776delinsVC突变患者，1例SD, PFS为3.8个月；1例PR，PFS为5.3个月；另1例SD，PFS为4.6个月。整体来看，吡咯替尼二线治疗整体HER2突变人群时，亦比阿法替尼有着更长的PFS获益(中位, 5.8对比2.8个月, P< 0.001)。
图1 PFS数据：阿法替尼一线(A)及二线(B)治疗YVMA/G776delinsVC突变, 吡咯替尼对比阿法替尼一线(C)及二线(D)治疗整体HER2插入突变患者疗效。
计算机3D模拟结果提示，该4类插入突变均位于HER2的ATP结合激酶区，尤其均位于C-螺旋后方的磷酸活化环状区。
图2 HER2基因第20号外显子C-螺旋及磷酸活化环，及四种插入突变发生位置
无论G776delinsVC、G776delinsVV还是G776delinsLC突变，均只轻微影响磷酸活化环状区中的氨基酸改变，但并不影响HER2激酶的整体蛋白空间构象及药物结合口袋，故此3种Gly776位点上的缺失-插入突变并不会影响抗HER2 TKI的结合。相比之下，虽然阿法替尼、达克替尼、波奇替尼对此3种突变结合活性都不错，但是吡咯替尼具有对其更低的自由结合能ΔGbind (ΔGbind负值越低，代表药物与分子结合越稳定)，预示着其更好更稳定的结合活性。但是，A775_G776insYVMA插入突变，却使得YVMA这一串额外的C-螺旋蛋白序列插入到了HER2的磷酸活化环状区中，不仅相应地改变了HER2蛋白的二级结构，而且插入的C-螺旋使得原有的药物结合口袋变窄，产生了明显空间阻隔效应，进而阻挡了多数抗HER2 TKI的有效结合。
图3 3D计算机模拟下的HER2插入突变蛋白空间构象
G776delinsVC (A)，G776delinsVV (B), G776delinsLC (C), 以及对标突变A775_G776insYVMA (D)。蛋白结构中黄色为野生型HER2，粉红色为相应突变型HER2。
分子对接模拟结果表明，吡咯替尼相对于阿法替尼、达克替尼和波奇替尼，对insYVMA插入突变有着更高的结合活性与稳定性，原因在于其与该突变有着更多的氢键形成和更多的其他分子间作用力。
图4 阿法替尼(A)和吡咯替尼(B)对A775_G776insYVMA突变蛋白的结合模式图
鉴于insYVMA在HER2中显示了更强的TKI抗性和更明显的蛋白构象空间改变，研究构建出了A775_G776insYVMA插入突变细胞株，测试了阿法替尼、达克替尼、波奇替尼、吡咯替尼4种TKI对该突变的抑制能力。虽然阿法替尼和达克替尼对HER2野生(WT) 细胞株抑制水平较强，但达克替尼对insYVMA突变的抑制能力更弱。相比之下，吡咯替尼对HER2野生型细胞株有着较强的选择性(抑制水平较弱)，但比阿法替尼和达克替尼对insYVMA的抑制功能更强。波奇替尼虽然对insYVMA突变细胞的抑制功能更强，但是其对HER2野生型细胞的抑制水平也更强，对突变的选择性不佳。这也是我们在临床上常看到HER2突变肺癌患者用吡咯替尼很少产生皮疹、黏膜炎等副反应，而使用波奇替尼却很常见到此类副反应的原因，正是药物与靶点选择性的原因。一个好的TKI，我们不仅希望它对特定突变有着强效的抑制活性，还希望它有着更强的选择性，在发挥抑制突变基因的同时，不波及损伤我们其他的正常基因(如皮肤、粘膜上皮EGFR)。
图5 四种抗HER2抑制剂(A)吡咯替尼、阿法替尼、达克替尼、波奇替尼对HER2野生型细胞株(B)及YVMA插入突变型细胞株(C)的功能抑制图，上述4种TKI对此二种HER2细胞的IC50数值。
通过上述讲解可以看出，目前中国HER2突变的NSCLC患者较常应用的TKI阿法替尼和吡咯替尼，对于特殊类型的HER2少见插入突变亚型-第776位密码子Gly处发生的缺失-插入取代突变(G776delinsVC为典型代表)均有着不错的疗效；此类非YVMA插入突变的临床靶向治疗策略选择可以更灵活、更宽泛。而对于HER2主流插入突变A775_G776insYVMA，吡咯替尼要比阿法替尼、达克替尼等有着更强的抑制能力，原因在于其对YVMA这种特殊的突变蛋白结构有着更强、更稳定的结合活性。临床遇到晚期HER2突变NSCLC患者，当施行靶向治疗时，区分插入突变的亚型及每种TKI的结合活性、选择性，以及考虑到药物的经济学、可及性、疗效及毒性，是一名优秀的肿瘤内科医生在治疗NSCLC少见驱动突变时应当综合考虑的问题。
原文：Yang G, Xu H, Hu J, Liu R, Hu P,Yang Y, Li W, Hao X, Zhang S, Xu F, Ai X, Li J and Wang Y (2022) Specific HER2 Exon 20 Gly776 Deletion-Insertions in Non-Small Cell Lung Cancer: Structural Analysis and Sensitivity to HER2-Targeted Tyrosine Kinase Inhibitors. Front. Pharmacol. 13:806737.
doi: 10.3389/fphar.2022.806737
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