纳米生物材料的生物应用
利用共价和非共价的作用方式将生物分子（抗体、DNA、蛋白质等）修饰到纳米材料上可得到生物复合的多功能纳米粒子。纳米生物复合材料在纳米载体、纳米医药及纳米生物组织工程等方面得到了越来越多的研究和应用。
纳米载体
由于细胞膜对带负电荷物种的排斥以及血清内核酸酶对基因的快速降解，生物、化学以及医学研究者一直致力于开发稳定的基因载体。在这方面，纳米粒子作为基因或药物载体在siRNA、质粒DNA以及药物传输中被广泛使用。2010年Moon等利用氨基修饰的聚-1,4-亚苯基-1,2-亚乙烯基纳米粒子材料实现了向植物原生体中传输siRNA，导致靶向基因沉默。该类材料在水溶液中处于疏松自由状态时可聚集，形成水合半径为60-80nm的纳米粒子。由于其带正电荷，通过静电作用容易与带负电荷的核酸结合并且在整个传输过程中对siRNA起到保护作用。研究发现，在原生质体合成阶段，这种纳米粒子材料可以将siRNA导入原生质体，对细胞壁的生物合成相关的NtCesA-1通路的沉默起到至关重要的作用。利用该纳米粒子的荧光特性，还可以监测siRNA导入原生质体的整个作用过程。2010年，Wang等报道了一种同时具有荧光成像和转染功能的双功能聚合物纳米粒子。因为侧链上修饰了磷脂和季铵盐基团。这个体系的设计有以下几个特点：两亲性的聚合物纳米粒子易于进入细胞；磷脂能够为聚合物疏水主骨架提供保护作用，提高了聚合物纳米粒子的生物相容性和光稳定性；带正电荷的季铵盐能够与核酸有效地结合，并实现荧光聚合物纳米粒子用于监测整个传输过程。正如所设计的，聚合物纳米粒子展示了高的光稳定性和低的细胞毒性，并且能够进入细胞，聚集在细胞核周围。通过静电作用形成的聚合物纳米粒子-pCX-EGFP（编码绿色荧光蛋白的质粒DNA）复合物能够被传输到A549细胞内。蓝色和绿色叠加色的出现表明GFP在A549细胞内发生了转录和翻译。为了发展长期且实时成像和基因传输的多功能体系，2013年Wang等制备了一种阳离子聚芴衍生物，它可以与质粒DNA形成紧密的纳米颗粒。所形成的聚合物纳米粒子的平均粒径为125nm，具有高的光稳定性、低的细胞毒性及高的荧光量子产率（43%）。聚合物纳米粒子能够有效地传输GFP表达的质粒DNA，并且能够达到92%的转染效率。转染效率与商业化的脂质体2000和聚乙烯亚胺（PEI）相当。
除了用于基因（siRNA和DNA）的传输之外，聚合物纳米粒子还可以作为靶向药物的传输载体和释放过程的监测试剂。与有机染料和无机量子点相比，聚合物纳米粒子在药物传输和释放过程监测上具有明显的优势。首先，它们具有好的生物相容性且无免疫原性；其次，能够控制药物释放到靶向肿瘤细胞上；最后，利用它们的自发荧光，能够监测药物的释放过程。2010年，Wang等制备得到了能够用于药物传输和同时释放监测的多功能聚合物纳米粒子。这个体系由一种阳离子聚合物和抗癌药物阿霉素（DOX）修饰的聚（L-谷氨酸）（PG）通过静电作用自组装形成粒径大约为50nm的聚合物纳米粒子。在这个体系中，共轭聚合物分子同时起到荧光成像试剂及药物传输和释放载体的作用，聚（L-谷氨酸）作为药物载体，并且能够被降解进而释放药物。
纳米医药
2005年，Wittenburg等发现在可见光照射下，阳离子共聚物PPE衍生物能够结合并杀死革兰氏阴性菌E.coli和革兰氏阳性炭疽芽孢杆菌B.anthracis，这一研究开启了共轭聚合物类纳米粒子在光动力治疗方面的新应用。之后，Wittenburg和他的合作者发展了多种用于光动力抗菌和抗肿瘤细胞的共轭聚合物，提出并证实了共轭聚合物光动力治疗的原理和机制。带正电荷的共轭聚合物通过静电作用能有效地捕获带负电荷的微生物病原体，并在光照下，敏化微生物病原体周围的氧气分子，产生单线态氧合活性氧（ROS）。产生的ROS损伤病原体的细胞膜，进而杀死病原体（细菌和细胞）。随后，Wang等设计并制备了由含有卟啉单元阳离子化合物的聚噻吩形成的静电复合物，所得静电复合物的粒径为1-4μm。由于此复合物具有强的光聚集和放大能力，因此具有强的光敏化能力进而提高了ROS产生能力。在可见光照射下，该静电复合物对革兰氏阴性菌E.coli和革兰氏阳性炭疽芽孢杆菌B.anthacis的杀伤效果分别达到75%和90%。
由于细胞膜表面带有大量的负电荷以及不同的蛋白标志物，能与带正电荷或特定识别元素的物种通过静电或配体-受体作用相结合。最近，Wang等设计并开发了同时具有抗菌、抗肿瘤及成像功能的多功能聚合物纳米粒子。这种多功能的聚合物纳米粒子由带正电荷的共轭聚合物与带负电荷且具有一定靶向能力的透明质酸通过静电作用制备而成。聚合物纳米粒子能够通过内吞方式定位于A549细胞的细胞质内。在可见光照射下，对细菌的杀伤能力可以达到90%以上，对肿瘤细胞的杀伤能力为60%左右。Wang等为了提高共轭聚合物的抗肿瘤效率，设计并制备了包含广谱抗癌药物苯丁酸氮芥和阳离子聚噻吩、平均粒径为50nm的聚合物纳米粒子。相比于单一的共轭聚合物或抗癌药物，聚合物纳米粒子的抗肿瘤效率提高了2-9倍，抗肿瘤效率的提高是由于共轭聚合物和抗癌药物的协同作用所致。
不同于之前报道的共轭聚合物与卟啉通过静电作用形成络合物来提高光敏化能力，2011年，Wang等通过共价方式得到连有卟啉单元的阳离子共轭聚合物，所形成聚合物纳米粒子平均粒径大约为350nm。由于卟啉和共轭聚合物之间可以发生荧光共振能量转移（FRET），使得该聚合物纳米粒子具有更强的光敏化能力。所得聚合物纳米粒子除了具有抗肿瘤能力外，还能够有效地区分活细胞和死细胞。为了能够靶向识别肿瘤细胞，聚合物的侧链用叶酸分子进行了修饰。细胞成像实验表明，该聚合物纳米粒子能特异性地靶向叶酸受体高表达的KB细胞，而对叶酸受体呈阴性的细胞NIH-3T3不识别。在可见光照射下，对叶酸受体高表达的阳性细胞的杀伤达到80%，而对叶酸受体呈阴性的细胞则有70%的存活率。
Wang等还制备了共轭聚合物/药物共轭体，可以抑制肿瘤细胞的生长。所得聚合物纳米粒子的平均粒径大约为31nm和83nm。利用药物的特异性和共轭聚合物光照敏化周围氧分子产生的ROS的能力，聚合物纳米粒子特异性地结合细胞内的蛋白（雌性激素受体）并且使蛋白失活，进而抑制MCF-7肿瘤细胞的生长。Chang等制备了平均粒径为70-120nm的具有核-壳结构的聚合物纳米粒子。然后通过共价结合方式，将对应HER2受体的抗体连接到聚合物纳米粒子。细胞成像实验表明，抗体复合聚合物纳米粒子能够靶向成像HER2高表达的肿瘤（MCF-7和435.eB细胞），而且聚合物纳米粒子也能够抑制HER2高表达的肿瘤细胞的生长。
纳米生物组织工程
由于聚合物纳米粒子的发光亮度高，细胞毒性低，细胞相容性好，因此在细胞成像、示踪方面得到了广泛的应用。目前聚合物纳米粒子作为荧光材料在体外（in vitro）和体内（in vivo），均可以荧光成像，但大部分研究集中在体外成像。从结合的特异性来看，聚合物纳米粒子的荧光成像包括非特异性成像和特异性靶向成像。
非特异性成像是指聚合物纳米粒子没有修饰靶向分子，只是通过聚合物纳米粒子本身的特性，通过细胞内吞的方式与细胞作用，进入细胞后主要定位于细胞质。如Wang等设计合成了连有烷氧链的中性两亲性的聚噻吩，并通过自组装的方法得到平均粒径为700nm的圆形聚合物纳米粒子。细胞成像实验表明聚合物纳米粒子定位于A549细胞核周围的细胞质内，具有高的光稳定性和低的细胞毒性。
相比于非特异成像，靶向成像更具有实际应用的意义，因为通过靶向成像能够精确地确定不同的细胞、组织及部位。靶向成像要求将具有靶向功能的生物分子（抗体、定位肽以及生物素等）修饰到聚合物纳米粒子上，得到具有靶向功能的聚合物纳米粒子。目前除了能制备得到靶向小分子（如叶酸）修饰的聚合物纳米粒子外，抗体以及生物素等修饰的聚合物纳米粒子也陆续被开发出来。这方面的代表工作有Liu等的研究，他们通过再沉淀的方法，以聚（DL-丙交酯-co-乙醇酸交酯）为包裹剂，以不同发射波长的共轭聚合物为单元，制备得到了不同颜色的聚合物纳米粒子。然后将具有靶向功能的叶酸小分子修饰到聚合物纳米粒子上，实现了对叶酸分子受体高表达的肿瘤细胞（MCF-7）的靶向识别成像。所得聚合物纳米粒子的平均粒径为243-273nm，在整个实验浓度范围具有低的细胞毒性。由于叶酸分子与肿瘤细胞表面受体的高效率结合，荧光成像展示出高的亮度。
Christensen等以PEG-磷脂为包裹剂，用四种不同发射颜色的共轭聚合物为和，制备得到了表面具有磷脂或羧基功能的聚合物纳米粒子。所得聚合物纳米粒子的平均粒径大约为21-26nm，并且具有好的两亲性、生物相容性和高量子产率。他们通过EDC催化缩合反应，将生物素（biotin）修饰到聚合物纳米粒子上，进而实现了与亲和素（streptavidin）修饰的玻璃基质的特异结合。同样，生物素修饰的聚合物纳米粒子能够特异性地与亲和素桥联的抗体结合，识别对应受体CD16/32高表达的J774A.1细胞，达到对肿瘤细胞的靶向成像。
除了利用生物素与亲和素特异性结合之外，抗体与抗原的结合也是理想的特异性识别体系。在这方面，Chiu等开展了一些工作，他们利用纳米沉淀的方法得到了羧基修饰的聚合物纳米粒子，所得聚合物纳米粒子的粒径大约为15nm，且具有高的发光亮度和低的细胞毒性。通过EDC催化酸胺缩合得到二抗、生物素或亲和素修饰的聚合物纳米粒子，实现对应一抗高表达的抗原或亲和素修饰的肿瘤细胞靶向成像。此外，除了利用EDC催化的酸胺缩合方式，Chiu等利用叠氮基团修饰的聚合物纳米粒子与炔基共孵育的细胞之间进行的Click生物正交反应实现对肿瘤细胞的靶向成像。
为了满足多通道细胞分析和成像，Wang等通过Heck反应合成了四种发射不同颜色的共轭聚合物，利用侧链能量传递效应得到了从蓝色到红色发光的共轭聚合物，尤其是包括三基元色（蓝色、绿色和红色）。对应的聚合物纳米粒子的平均粒径为50-100nm，细胞成像实验表明这些聚合物纳米粒子能够进入细胞质并主要集中在细胞核周围。值得注意的是，在细菌E.coli的介导下，共轭聚合物能够发生有效的荧光共振能量转移，得到发射波长为400-700nm的不同颜色的微球，并且这些不同颜色编码的微球可以用于细胞成像，同样定位于细胞质内。在不同的激发波长下，这些微球能够发生170nm的斯托克斯位移。由于这些微球的低细胞毒性和颜色可控性，它们能够应用于多色细胞成像和光学编码上，并为实现多通道生物监测提供新的思路。
相比于聚合物纳米粒子在体外的成像，由于体内各种生物屏障和复杂的生物环境，将纳米粒子应用于体内成像是比较困难和复杂的。由于远红外和近红外发射具有生物自发荧光低和组织渗透能力高的优点，红光发射材料得到了研究者的青睐。2010年Kim等用含有氰基乙烯主骨架的聚合物纳米粒子实现了体内淋巴结的实时成像。制备的聚合物纳米粒子的发射能够覆盖整个可见光范围，平均粒径大约为60nm。为了实现聚合物纳米粒子在体内靶向成像和磁响应成像，Liu等设计并制备了叶酸修饰的磁纳米颗粒。该体系中包括芴噻唑共轭聚合物、磷脂修饰的氧化铁、叶酸修饰的聚（乳酸-co-羟基乙酸）-聚（乙二醇）以及聚乳酸-羟基乙酸共聚物。电子显微镜和动态光散射测试结果发现所得聚合物纳米粒子是光滑的球形结构，平均粒径为180nm。体内成像实验表明，当将这种聚合物纳米粒子注射到叶酸受体高表达的肝肿瘤移植老鼠体内时，能够清楚地看到肿瘤部位有比较高的荧光信号，然而其他部位如心、肺、头部、脾脏、肾脏以及肌肉也能够看到相应的荧光信号。
远红外和近红外聚合物纳米粒子虽然具有比较好的组织穿透力，但是其荧光量子产率却大大降低。为了克服这个问题，Chiu等利用荧光共振能量转移制备了羧基功能化的聚合物纳米粒子。所得聚合物纳米粒子粒径大约为15nm，具有56%的荧光量子产率，最大发射峰在650nm。同样将具有靶向功能的氯毒素（CTX）和生物相容性的PEG修饰到聚合物纳米粒子得到CTX-聚合物纳米粒子。由于氯毒素能够与神经外胚层的肿瘤特异性结合，当CTX-聚合物纳米粒子注射到有症状的ND2：SmoA1或野生型的（作为对照）小鼠体内之后，CTX-聚合物纳米粒子能够特异性地识别并积累在ND2：SmoA1部位。组织学分析表明CTX-聚合物纳米粒子能够较好地靶向在ND2：SmoA1小鼠小脑。虽然，对比PEG修饰的聚合物纳米粒子与CTX修饰的聚合纳米粒子，定位的部位没有明显的区别，但这一途径为以后体内靶向成像提供了一定的参考。
纳米生物材料的优选标准
①易于修饰。首先对单体进行修饰，如将烷氧链、靶向基团以及电荷等修饰到单体上，然后将生物元素修饰过的单体进行聚合，得到的聚合物就具有一定的生物功能，接着制备得到生物复合的聚合物纳米粒子。最简单的就是通过疏水或静电作用，用包含生物功能团的聚合物包裹共轭聚合物形成聚合物纳米粒子，实现聚合物纳米粒子的生物功能化。聚乙二醇（PEG）也是常用的修饰单元，因为PEG具有好的水溶性和生物相容性，而且不同长度的PEG链能够满足各种生物应用。另外，其他特定的功能基团如羧基、氨基、磷脂以及生物分子容易修饰到PEG上，进而得到不同功能的聚合物纳米粒子。还有表面羧基、氨基或叠氮修饰的聚合物纳米粒子，然后通过EDC催化下的酸胺缩合或Cu催化下的Click偶联反应，将具有特定生物功能的分子通过共价方式连接到聚合物纳米粒子上得到生物复合物的聚合物纳米粒子。
②具有高的光稳定性。对于高分子材料而言，光稳定性主要是指其抵抗光老化的性能。高分子材料在使用环境下因受到各种环境因素如光、热、氧、水分、微生物等的作用会发生老化降解。而白光范围内的近紫外光虽然含量少，但是能量高，足以引起高分子链上大部分化学键的断裂而降解。它的照射是高分子材料受到破坏的主要原因，氧的存在则能进一步促进这一老化过程，使材料性能劣化，增加其使用的不确定性。
③低的细胞毒性。细胞毒性是化学物质作用于细胞基本结构和/或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和功能的紊乱，所引发的不良反应。化学物质体外细胞毒性与其引起的动物死亡率及人体死亡的血药浓度之间都存在良好的相关性。化学物质产生的损伤和死亡，最终可表现为细胞水平上的改变，由此推测体外细胞毒性可以预测体内急性毒性。因此，低的细胞毒性、良好的细胞相容性是纳米生物材料应该重视的一点。
本文整理由长三角肺癌之纳米工程青年团队完成。
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