通过一些生信分析手段选定了一个lncRNA/circRNA的时候要如何确定它的亚细胞定位，明确其分子功能呢？进行后续的基础实验研究呢？小薇今天就掰开来揉碎了跟大家好好说说。
让大家在后续的实验方案或者标书技术路线方案设计中选择最适合自己的解决办法。
大家都熟知非编码RNA的分子功能与其所在的亚细胞位置密切相关。比如，位于细胞核或染色体上的lncRNA常通过影响表观遗传修饰和转录过程来调控基因表达，也可以通过直接与靶基因结合来激活或抑制靶基因的表达。然而，细胞质中的lncRNA则更可能参与翻译调控或通过吸附miRNA来发挥ceRNA功能。特殊细胞器定位的组织特异性lncRNA则可参与细胞器的功能和代谢调控，如线粒体的氧化反应和稳态平衡等。
一般来讲，研究lncRNA亚细胞定位的方法有：荧光标记探针进行荧光原位杂交（FISH）、分离胞浆和胞质的RNA进行PCR检测（核质分离）。
1. FISH方法和结果解读
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先来了解下什么是FISH
采用了已知序列的、特异性的单链核酸作为探针，标记了生物素或荧光素，在一定的条件下通过碱基互补配对法则，使得DNA-DNA原位杂交，采用荧光法显色，最终将DNA在细胞爬片、石蜡切片或者冰冻切片的原始位置上标记出来的一种技术。用荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，更直观。
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写作要点
样品固定和预处理，探针和样品变性，杂交，洗脱，杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针），封片、荧光显微镜观察FISH结果。当然现在也有成熟的试剂盒，方法部分也可以简化处理。
文献示例1（影响因子=41.4，PMID: 31752906）
Hu et al. Molecular Cancer (2019) 18:167 ，https://doi.org/10.1186/s12943-019-1097-9
方法解析1
细胞样本（NOZ和SGC-996细胞），固定（4%多聚甲醛），变性和杂交（蛋白酶试剂处理后，用预杂交缓冲液40°C孵育4 h，然后用地高辛标记探针40°C杂交过夜。）杂交信号扩大（用SABC-FITC在37°C孵育30分钟）。共聚焦显微镜观察。
结果解析1
DAPI蓝色荧光代表细胞核，FITC绿色荧光探针代表lncRNA，merge后明显可以看到该lncRNA分布在细胞质中。
文献示例2（影响因子=23.168，PMID: 35526050）
方法解析2
本文方法描述比较简单，直接说明FISH试剂盒（厂家，产地），说明按照试剂盒的操作说明进行实验的。本文作者还设置了阳性对照探针U6和18S（细胞核和细胞质组分），这点还是比较严谨的。
结果解析2
DAPI 细胞核(蓝色), lncROPM (红色), 18S 细胞质(红色), U6 细胞核(红色)。结果显示，lncROPM主要位于细胞质中。
2. 核质分离方法和结果解读
核膜有内核膜和外核膜两层，差不多各8nm左右，比胞膜韧，用低渗处理的时候，胞里边多的是液状的胞质，胞质膨胀所以破膜，在未破膜之前，胞浆比核内渗透高，所以核还是处于一个高渗的状态，破膜之后，核处于低渗状态，但由于不同的渗透耐性，核膜不会破。
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写作要点总结
细胞系，细胞处理剂及时间（视具体实验而定），细胞质提取液成分，细胞核提取液成分，离心的条件。核质分离基本都是用试剂盒来提取分离，所以也可以简化。
文献示例1（影响因子=23.168，PMID: 35526050）
方法解析1
本文采用的就是简化处理办法，直接说明试剂盒，然后qRT-PCR检测相对表达。也设置了U6作为核内参，GAPDH作为细胞质内参。对于核质分离实验来说qRT-PCR检测中的核质内参还是要交代清楚的，这点很有必要。
结果解析1
qRT-PCR柱状图展示lncROPM主要在细胞质中表达。与FISH结果一致，更具说服力。
文献示例2（影响因子=6.832，PMID: 35212607）
方法解析2
本文方法部分比上一篇稍微详细了点，可以看到离心速度和时间。但试剂盒基本没啥问题，按照说明书方法来写就可以的。
结果解析2
核质分离的qRT-PCR检测结果显示lncRNA PEG10主要定位于细胞质中。
总结
FISH与核质分离实验有相同的功能，都可以观察lncRNA的亚细胞定位，即lncRNA定位于胞浆还是胞核；FISH的图片应标注清楚每个图片中荧光所表示的分子，分组情况也要表明图注中应该包含细胞系的名称和处理方法，每种颜色的所代表的分子，这里标注的方式比较特别，直接在图上用不同的颜色来输入分子名称，用以代表荧光颜色，如红色、绿色、蓝色书写lncROPM，FITC和DAPI名称表示红色、绿色、蓝色荧光分别代表这三种分子；也可以直接在图注中写出来，如“Fluorescent staining: DAPI (blue), lncROPM (red), 18S (red), U6 (red)”。荧光图的放大倍数应该直接标注出来，或者也可以是在方法部分给出。例如文献2中图注描述 (Original magnifcation,×200, Scale bar, 50 μm)。
关于非编码RNA细胞定位的方法和结果解读，今天就分享到这里了，希望对你有用。关注小薇，科研道路上我们相互结伴，共同进步！
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