【资源】工业发酵染菌的防治

第一节 发酵染菌的危害
发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。
所谓“杂菌”， 是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。
几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。
一，染菌对不同品种发酵的影响
青霉素
疫苗
柠檬酸
谷氨酸
肌苷、肌苷酸
酶制剂

二，不同种类的杂菌对发酵的影响
青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大
链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大
四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大
柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌
肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大
谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体
高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大

三，不同染菌时间对发酵的影响
1，种子培养期染菌
菌体浓度低、培养基营养丰富
2，发酵前期染菌
杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成
3，发酵中期染菌
严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成
4，发酵后期染菌
如杂菌量不大，可继续发酵。如污染严重，可采取措施提前放罐

四，不同染菌途径对发酵的影响
种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性
空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐
培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性
设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大

五，染菌对产物提取和产品质量的影响
1，对过滤的影响
发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度加度。造成过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率。
2，对提取的影响
（1）有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开
（2）离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量
3，对产品质量的影响
（1）对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。
（2）对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。

六，染菌对三废处理的影响
使过滤后的废菌体无法利用，发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增加三废治理费用和时间。

七，发酵染菌的危害
1，直接经济损失
2，间接经济损失

第二节 发酵过程中染菌的检查判断
一，杂菌的检查方法
借助适当的方法，才能正确而及时地发现发酵过过程是否污染杂菌和染菌的原因与途径。检查杂菌的方法，要求淮确可靠和快速，这样才能在短时间内获得效果。
目前生产上常用的检查方法有：①显微镜检查；②平板划线检查；③肉汤培养检查。
判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据。
无菌试验的目的：
（1）监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底
（2）监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入
（3）了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角

二，各种检查方法的比较
3种方法各有优缺点，显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜捡取样少，视野的观察面也小，因此不易捡出早期杂菌。平板划线法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能捡出更少的杂菌。

三，杂菌检查中的问题
1，检查结果应以平板划线和肉汤培养结果为主要根据
2，平板划线和肉汤培养应做三个平行样
3，要定期取样
4，酚红肉汤和平板划线培养样品应保存至放罐后12小时，确定为无菌时方可弃去
5，取样时防止外界杂菌混入的措施

四，检查的工序和时间
选择那些生产工序和时间的样品检查也是十分重要的问题。科学合理的选择检查工序和时间，对于除去已污染杂菌的物料，避免下道工序再遭染菌，有着直接的指导意义。有时即使由于检查时间较长，未能及时据导本批生产，但对于找出造成染菌事故的环节，分析染菌原因，杜绝染菌漏洞也是不可缺少的。
由于生产菌种相产品的不同，检查的时间也不完全一样：但总的原则是一致的，即每个工序或经一定时间都应进行取样检查。
检查的一般时间或工序见下表。
发酵过程的杂菌检查

除了以上的方法外，在实际生产中还可以根据pH值、尾气中CO2含量和溶解氧等参数的异常变化来判断是否染菌。

第三节发酵染菌率和染菌原因的分析
发酵染菌能给生成带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。发酵设备、空气除菌系统和培养基灭菌系统等的有关设备以及管道的配置都必须严格符合无菌要求。如果设备结构和管道配置不合理，制造、安装不注意或在发酵过程中操作不慎就会使发酵液污染杂菌，导致产量下降甚至得不到产品。在发酵前期或中期染菌，杂菌会很快消耗掉营养物质，使生产菌无法正常生长而引起倒罐。在发酵后期染菌，虽然没有早期或中期染菌的影响大，一般会使产率下降并影响产物的提取，但如核苷酸等某些产品的发酵即使在后期染菌，也会使发酵产物被所染杂菌迅速消耗掉而得不到产品。因此，染菌问题是影响产率和后工序操作的主要因素之一，必须予以重视。认为染菌是不可避免的，这是一种错误看法。“决定的因素是人不是物”。只要我们思想上重视，对各个因素和环节周密考虑、严格掌握，是完全可以避免和减少污染的。
本节将根据以往工厂中发生染菌事故的经验教训来分析发酵系统中染菌的原因，来认识整个发酵过程中可能造成污染的各种途径并提出相应的防治措施。由于发酵生产的连贯性强，在整个生产过程中各个环节的污染问题都不能忽视，所以本章除了着重讨论发酵设备方面的污染防止问题外，对于培养种子设备的要求和有关操作方法也作一般介绍。
一、发酵染菌率
1，总染菌率：指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比乘以100得到的百分率。
2，设备染菌率：统计发酵罐或其他设备的染菌率，有利于查找因设备缺陷而造成的染菌原因。
3，不同品种发酵的染菌率：统计不同品种发酵的染菌率，有助于查找不同品种发酵染菌的原因。
4，不同发酵阶段的染菌率：将整个发酵周期分成前期、中期和后期三个阶段，分别统计其染菌率。有助于查找染菌的原因。
5，季节染菌率：统计不同季节的染菌率，可以采取相应的措施制服染菌。
6，操作染菌率：统计操作工的染菌率，一方面可以分析染菌原因，另一方面可以考核操作工的灭菌操作技术水平。

二、染菌原因的分析
避免在发酵生产中污染杂菌应以预防为主。“防重于治”，事前防止胜于事后挽救。 如果一旦发生染菌现象就要尽快找出原因及时纠正、堵塞漏洞才能减少损失，并从中吸取经验教训，避免以后有类似情况发生，保持生产的正常进行。但在发酵生产中，往往因为生产过程的环节很多，同时各工厂的生产设备、产品种类和管理措施不尽相同，引起染菌的原因比较复杂，有时不能及时找出而耽误了生产。如果原因一经查出，解决的办法还是比较容易和迅速的。所以，我们必须善于透过现象看本质，对染菌的情况作具体分析，不致盲目寻找而耽误了时间，也不致于将染菌的真正原因遗漏而造成连续染菌事故。下面根据发酵工厂的生产经验，从一般染菌的现象来分析引起染菌的可能原因。
1，国外一抗生素发酵染菌原因的分析
染菌原因 百分率（%） 染菌原因 百分率（%）
种子带菌 接种时罐压跌零 培养基灭菌不透 空气系统带菌 搅拌轴密封泄漏 泡沫冒顶 夹套穿孔 9.640.190.7919.962.090.4812.36 蛇管穿孔 接种管穿孔 阀门泄漏 罐盖漏 其他设备漏 操作问题 原因不明 5.890.391.451.5410.1310.1524.91
2，国内一制药厂发酵染菌原因的分析
染菌原因 百分率（%）
外界带入杂菌（取样、补料带入）设备穿孔空气系统带菌停电罐压跌零接种蒸汽压力不够或蒸汽量不足管理问题操作违反规程种子带菌原因不明 8.207.6026.001.6011.000.607.091.600.6035.00
上述资料是国内外抗菌素生产中统计了多年生产中发生染菌现象的各种原因所占的百分比，今列出以供参考。从发酵工厂的生产经验来看，染菌原因是以设备渗漏和空气系统的染菌为主，其他则次之。
3，从染菌的规模来分析染菌原因
（1）大批发酵罐染菌
整个工厂中各个产品的发酵罐都出现染菌现象而且染的是同一种菌，一般来说，这种情况是由使用的统一空气系统中空气过滤器失效或效率下降使带菌的空气进入发酵罐而造成的。大批发酵罐染菌的现象较少但危害极大。所以对于空气系统必须定期经常检查。
（2）分发酵罐(或罐组)染菌
生产同一产品的几个发酵罐都发生染菌，这种染菌如果出现在发酵前期可能是种子带杂菌，如果发生在中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的。通常同一产品的几个发酵罐其补料系统往往是共用的，倘若补料灭菌不彻底或管路渗漏，就有可能造成这些罐同时发生染菌现象。另外，采用培养基连续灭菌系统时，那些用连续灭菌进料的发酵罐都出现染菌，可能是连消系统灭菌不彻底所造成的。
（3）个别发酵罐连续染菌和偶然染菌
个别发酵罐连续染菌大多是由设备问题造成的，如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损，特别是冷却管的不易觉察的穿孔等。设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象，即第二批的染菌时间比第一批提早，第三批又比第二批提早。至于个别发酵罐的偶然染菌其原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。
4，从染菌的时间来分析
发酵早期染菌，一般认为除了种子带菌外，还有培养液灭菌或设备灭菌不彻底所致，而中、后期染菌则与这些原因的关系较少，而与中间补料、设备渗漏以及操作不合理等有关。
5，从染菌的类型来分析
所染杂菌的类型也是判断染菌原因的重要依据之一。 一般认为，污染耐热性芽抱杆菌多数是由于设备存在死角或培养液灭菌不彻底所致。污染球菌、酵母等可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的。在检查时如平板上出现的是浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌)，由于这种菌主要生存在水中，所以发酵罐的冷却管或夹套渗漏所引起的可能性较大。污染霉菌大多是灭菌不彻底或无菌操作不严格所致。
综上所述，引起染菌的原因很多。“世界上的事情是复杂的，是由各方面的因素决定的。”我们不能机械地认为某种染菌现象必然是从某一途径引起的，应该把染菌的位置、时间和杂菌的类型等各种现象加以综合分析，才能正确判断从而采取相应的对策和措施。

第四节发酵染菌的防止
一、种子带菌的原因及防止
1，带菌的原因
（1）无菌室的无菌条件不符合要求；
（2）培养基灭菌不彻底；
（3）操作不当。
2，种子带菌的防止
种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。
（1）无菌室
接种、移种等无菌操作需要在无菌室内进行。无菌室面积不宜过大，一般约4~6米2高约2.6米。为了减少外界空气的侵入，无菌室要有1~3个套间(缓冲过道)(参照下图)。无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求无裂缝，墙角最好做成圆弧形，便于揩擦清洗以减少空气中微生物的潜伏场所，室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。通常用30瓦紫外线灭菌灯照射20~30分钟即可。紫外线杀菌的效率还与室内空气的性质有关；空气温度高杀菌效率高，空气中灰尘多杀调效率低，而相对湿度高则紫外线灯的使用寿命长。紫外线能穿过石英但不能透过玻璃。

无菌室的立视图
配合使用的化学灭菌药剂有：用作喷洒或揩擦的(以揩擦为主)有75%酒精、0.25%新洁而灭(季胺盐)、0.6~1%漂白粉、0.5%石炭酸、0.5%过氧乙酸、1%煤酚皂(来苏尔)、0.5%高锰酸钾、300单位/毫升土霉素、50单位/毫升制霉菌素等；用作熏蒸的有甲醛(每立方米空间约用10毫升)或硫磺(每立方米空间约用2~3克)。要根据不同情况采用不同的灭菌剂。如检查出无菌室中潜伏的微生物中细菌较多，用石炭酸、土霉素等灭菌较好；如无菌室中霉菌多可以采用制霉菌素；如有噬菌体则用甲醛、双氧水或高锰酸钾等较好。
无菌室内无菌度的要求是：把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的菌落在3个以下为好。
在种子的无菌条件不要求很高的情况下，可以不采用无菌室而直接用无菌箱进行操作，但无菌要求很高的情况下，即使在无菌室内还要用无菌箱操作。
无菌室的利用次数要恰当，每次使用时间也不宜过长。用具要经蒸汽灭菌或用灭菌剂揩擦后才能带入使用。
（2）灭菌锅
灭菌锅是一种压力容器，作为培养种子及小型试验用具的灭菌之用，有立式和卧式两种。灭菌操作时需要注意排气管是否畅通，因为灭菌锅的排气管较小，易被铁锈或瓶子破碎后的培养基等所堵塞。如果排气管不道，锅内空气排不出去形成气团，蒸汽就不易渗入，从而使灭菌不彻底。用某种较耐热的芽抱杆菌进行试验证明：在排气不通畅的情况下，以1公斤/厘米2的蒸汽压力经30分钟灭菌后进行检查，发现某些部位的三角瓶中，灭菌前放入的芽抱杆菌没有被杀死。如果不是采用蒸汽而是用锅内烧水的办法进行灭菌，那末排气的时间更要长一些，不然水蒸汽来不及驱出空气而使被灭菌的瓶中的冷空气排不尽。
通入蒸汽后使瓶内培养基温度达到121ºC所需的时间与瓶内培养基的体积有关，其试验结果见下表。
通入表压为1公斤／厘米2的蒸汽时，三角瓶中培养基的体积与升温时间的关系

实际上，使用蒸汽的压力一般大于1公斤/厘米2，所以上表的数据仅供对照参考，但根据上表的试验结果可以说明培养基体积与升温时间的关系。
（3）摇瓶机
摇瓶机(亦称摇床)是培养好气菌的小型试验设备或作为种子扩大培养之用，常用的摇瓶机有往复式(图7-2)和旋转式(图7-4)两种。往复式摇瓶机的往复频率一般在80~140次／分，冲程一般为6~14厘米，如频率过快、冲程过大或瓶内液体装料过多，在摇动时液体要溅到包瓶口的纱布上易引起染菌，特别是启动时更易发生这种情况。
旋转式摇瓶机的偏心距一般在3~6厘米之间，旋转次数为60~300转／分。
放在摇瓶机上培养瓶中发酵液所需的氧是由室内空气经瓶口包扎的纱布(一般是八层)或棉塞通入的，所以氧的传递与瓶口的大小，瓶口的几何形状和棉塞或纱布层的厚度和密度有关。在通常情况下，摇瓶的氧吸收系数(亚硫酸氧化值)Kd取决于摇瓶机的特性和三角瓶的装料量，见表7-2。
往复式摇瓶机(图7-2)是利用曲柄原理带动摇床作往复运动，机身为铁制或木制的长方形框子，有一层至三层托盘，托盘上开有圆孔备放培养瓶，孔中凸出一三角形橡皮，用以固定培养瓶并减少瓶的震动，传动机构一般采用二级皮带轮减速，调换调速皮带轮可改变往复频率。偏心轮上开有不同的偏心孔，以便调节偏心距。往复式摇瓶机的频率和偏心距的大小
对氧的吸收有明显的影响。据有关文献报导，当冲程为10厘米、往复频率为200次/分，Kd值可达2.41毫克分子氧/升，分，大气压；当冲程为5厘米、往复频率240次/分时，Kd值可达1.25毫克分子氧/升，分，大气压。

根据支承装置结构不同，往复式摇瓶机分为滚轮式和悬挂式两种。 滚轮式摇瓶机是将摇床置于四个滚轮上，悬挂式摇瓶机(图7-3)是用四条吊杆将摇床吊在机架上，结构较为简单，托盘可装至三层以上，能放5~10升甚至更大的瓶，动力消耗较少。但悬挂式摇瓶机如为多层时，每层的冲程不一样，越是上层冲程越小。故使用多层悬挂式摇瓶机时应予注意。
旋转式摇瓶机是利用旋转的偏心轴使托盘摆动，托盘有一层或两层，可用不锈钢板、铜板、塑料板或木板制造。托盘由三根呈等边三角形分布的偏心轴支承，也有用滚动轴承作支承的。在三个偏心轴上装有螺栓可调节上下，使托盘保持水平。此种摇瓶机结构比较复杂，加工安装要求比往复式高，造价也较贵。其优点是氧的传递较好，功率消耗小，培养基不会溅到瓶口的纱布上。
有关文献报导，采用旋转式摇瓶机，对于300毫升或600毫升的三角瓶，当转数在500转/分和具有各种挡板条件下，与实装培养液10升具有六叶涡轮搅拌器的实验型发酵罐（通风率0.6米vvm；1000转/分)的Kd值一样。所以摇瓶机将成为放大发酵试验过程中的一种更有效的工具。

二、发酵设备、管件的渗漏与配置
设备和管件的渗漏一般是指设备和管件由于腐蚀、内应力或其他原因形成微小漏孔所发生的渗漏现象。这些漏孔很小，特别是不锈钢材料形成的漏孔更小，有时肉眼不能直接觉察，需要通过一定的试漏方法才能发现。
（一）发酵罐的渗漏
1，冷却管的渗漏
由于发酵液具有一定的酸度和含有某些腐蚀性强的物质(如亚硫酸盐、硫酸铵等)冷却钢管很易受到腐蚀。发酵液中含有固体物料时，固体物料因搅拌桨的搅动与冷却管摩擦而引起管外壁磨损。管内冷却介质一般为井水或自来水，因水的化学成分和流动时的冲击以及加热时蒸汽冲击的影响，管内壁也会引起腐蚀及磨损。所以冷却管是发酵罐中最容易渗漏的部件之一。 而最易穿孔的部分是冷却列管的弯曲处，原因是弯曲处外壁减薄和加热煨弯时使材料的性质有所改变所致。冷却水的压力通常大于罐压，如果有微孔，冷却水就会进入发酵液而引起染菌。
检查列管有否渗漏，在漏孔极其微小时是不易发现的。需要将管外壁的污垢铲除后，将管子烘干，管内加水压，才能发现渗漏的部位。管子与罐体的连接方式有两种：法兰联接和焊接。法兰虽然易于拆卸更换，但联接处有垫片易渗漏，而焊接则无此种现象。为了及早发现漏孔予以排除，冷却管要定期检查作渗漏试验。
试漏方法有两种：气压试验和水压试验。水压试验是用手动泵或试压齿轮泵将水逐渐压入冷却管，泵到一定压力时，观察管子有否渗漏现象。气压法是先在发酵罐内放满清水，用压缩空气通入管子，观察水面有无气泡产生以确定管子有否渗漏和渗漏的部位。气压法快速方便，但管子下部弯曲处积水不易排尽，有漏孔时不产生气泡就难以发现。采用不锈钢制造的冷却管，耐腐蚀情况比普通钢管要好得多，产生漏孔的机会也比普通钢管少。但如加工时不符合不锈钢材料加工的技术要求(如热处理，焊条牌号的选择及焊接工艺等)，就会改变不锈钢材的结晶组织，发生危害较严重的晶间腐蚀现象。
2，罐体的穿孔
浸没在液体中的罐体部分都有可能发生腐蚀穿孔，特别是罐底，由于管口向下的空气管喷出的压缩空气的冲击力以及发酵液中的固体物料在被搅动时对罐底发生摩擦，罐底极易磨损引起渗漏，这种磨损形式是钢板产生麻点般的斑痕，称为麻蚀。每年大修时需检查钢板减簿的程度。有夹套的发酵罐可在夹套内用水压或气压的试验方法检查罐壁有无渗漏。
有保温层的发酵罐，如果水经常渗入保温层并积聚在里面，罐外壁就产生不均匀的腐蚀现象，所以当保温层有裂缝和损坏时，应及时修补。
（二）管件的渗漏
与发酵罐相连接的管路很多，有空气、蒸汽、水、物料、排气、排污等管路，管路多，相应的管件和阀门也多。管道的连接方式、按装方法以及选用的阀门形式对防止污染有很大的关系。所以，与发酵有关的管路不能同一般化工厂的化工管路完全一样，而有其特殊的要求。
1，阀
据统计，因阀的渗漏引起的染菌占染菌率的比例很大，值得引起重视。与发酵罐直接连通的管道更应选用密封性较高的阀门。目前使用的大小阀门大多采用截止阀和橡胶隔膜阀。
（1）截止阀(图7-6)
阀体为横放的S形，阀座与阀心的接触面小，污物不易附在上面，但构造比较复杂，流体阻力较大。由于截止阀能很方便地调节流量，小型发酵罐上大多采用这种阀门。平面形紧密面的垫料采用橡胶或聚四氟乙烯，关闭后垫料与阀座紧紧地吻合，达到不漏的目的。阀心垫料需定期检查，损坏后立即调换。截止阀在使用中经常发生以下两个问题：
①阀心轧坏。物料中的硬质物或焊接施工后的焊渣以及螺钉零件等被带到阀内，当关闭时，阀心与阀座被上述坚硬物轧住，能将紧密面轧成凹凸不平的痕迹，就关不严密。
②填料的渗漏。操作时用扳手过分关紧，会使阀杆弯曲，弯曲后的阀杆不仅启动费力，并且使填料部分不紧密而引起渗漏，操作中需要注意。阀门在使用一定时间后，阀杆磨损或填料损坏也会引起渗漏，就需要将填料压盖适当拧紧或更换填料。

（2）隔膜阀
隔膜阀的结构见图7-6。阀体内装有橡皮隔膜，用螺钉与阀芯连接，当阀杆作上下运动时就带动隔膜上升或下降。隔膜阀的制造要求不高，关键在于膜的性能，如采用橡皮隔膜阀，在一般情况下，对橡胶隔膜的要求是耐压4公斤/厘米2以上，耐温160℃以上，在压紧和放松时不变形。隔膜阀有以下优点：
1)严密不漏。2)无填料。3)阀结构为流线型，流量大，阻力小，无死角，无堆积物，在关闭时不会使紧密面轧坏。4)检修方便。但须定期检查隔膜有否老化及脱落。

2，管路的连接
管子的连接有螺纹连接、法兰连接和焊接三种。
(1)螺纹连接
螺纹连接需在管端铰出管螺纹，安装时在螺纹上涂以白漆并加麻丝(也有用聚四氟乙烯薄膜)作为填料，如密封要求高的可用石墨粉加少许机油作为填料，或用氧化铅甘油胶合剂更好。螺纹连接简单，但装拆较麻烦，为了便于装拆，要在管路上适当位置安装活接头(亦称“由宁”)，接头平面用石棉橡胶板或橡皮等作垫圈。由于管路受冷热和震动的影响，活接头的接口易松动，使密封面不能严密而造成渗漏。如在接种输液时，因液体快速流动造成局部真空，在渗漏处将外界空气吸入、空气中的菌就被带入发酵罐中而造成危害。所以，重要的管路连接大多采用法兰连接。
（2）法兰连接
法兰连接密封可靠，压力、温度和管径的适用范围大，但费用较高。
（3）焊接
焊接的方法比其他方法简便，而且密封可靠。所以空气灭菌系统、培养液灭菌系统和其他物料管路以焊接连接为好。但需经常拆卸的管路则不宜用焊接连接。
管路、管件的试漏一般在管路中通入压缩空气并在焊缝和连接处涂以肥皂水，如有肥皂泡发生，则表示此处有泄漏，需重新焊接或安装。
（三）管路的配置
1，排气管与下水管

发酵厂中若干发酵罐的排气管路大多汇集在一条总的管路上，以节约管材，下水管亦然。但在使用中有相互串通，相互干扰的弊病，一只罐染菌往往会影响其他罐。排气管路的串通连接尤其不利于污染的防止。故对于排气和下水管路要考虑发酵的特点进行配置，对于容易染菌的场合还是以每台发酵罐具有独立的排气、下水管路为宜。倘若使用一根总的排气管时，必须选择较大直径的管子，保证排气下水通畅不致倒回到发酵罐内。
2，发酵罐的管路
图7-7表示发酵罐(带空气分过滤器)的水、蒸汽和物料管路的配置。如有自控和测量仪表，那末还应包括这些仪表所需的有关管路(图中末包括)。由于罐体和有关管路均需用蒸汽进行灭菌，所以要保证蒸汽能够达到所有需要灭菌的地区，对于某些蒸汽可能达不到的死角(如阀)要装设与大气相通的旁路(图中的小阀门)。在灭菌操作时，将旁路阀门打开，使蒸汽自由通过。接种、取样和加油等管路要配置单独的灭菌系统，使能在发酵罐灭菌后或在发酵过程中单独进行灭菌。
（四）发酵罐与管件的死角
所谓死角是指灭菌时因某些原因使灭菌温度达不到或不易达到的局部地区。发酵罐及其管路如有死角存在，则死角内潜伏的杂菌不易杀死，会造成连续染菌，影响生产的正常进行。现将经常出现死角的场合及形成死角的几种原因介绍如下：
1，法兰连接的死角
如果对染菌的概念了解不够，按照一般化工厂管路的常规加工方法来焊接和安装管道法兰就会造成死角。发酵工厂的有关管路要保持光滑、通畅、密封性好，以避免和减少管道染菌的机会。例如法兰与管子焊接时受热不匀使法兰翘曲密封面发生凹凸不平现象就会造成死角(图7-8c)。垫片的内圆比法兰内径大或比较小以及安装时没有对准中心也会造成死角(图7-8a、b)。

2，渣滓在罐底与用环式空气分布管所形成的死角
培养基中如果含有钙盐类及固形物，在发酵罐的搅拌功率较小和采用环式空气分布管的情况下，由于在灭菌时培养基得不到强有力的翻动，罐底会形成一层1—2毫米甚至更厚的膜层(图7-9)。这种膜层具有一定程度的绝热作用，所以膜层下潜伏的耐热菌不易被杀死。对这种情况的发酵罐必须定期铲除罐底积垢。大的发酵罐，为了减少搅拌轴的摆动，罐底装有底轴承，轴承支架处也容易堆积菌体。如果在底轴承下增设一个小型搅拌桨就可以适当改善罐底积垢的情况(图7-10)。环式空气分布器在整个环管中空气的速度并不一致，靠近空气进口处流速最大，远离进口处的流速减小，当发酵液进入环管内，菌体和固形物就会逐渐堆积在远离进口处的部分形成死角，严重时甚至会堵塞喷孔(图7-11)。

发酵罐中除了上述容易造成死角的地区外，其他还有一些容易造成死角的地区，如挡板(或冷却列管)与罐身固定的支撑板周围和不能在灭菌时排气的百肠管，温度计接头等，对于这些地区每次放罐后的清洗工作应注意，经常检查。仔细清洗才能避免因死角而产生的污染事故。

3，不锈钢衬里的死角
某些有机酸的发酵对碳素钢有腐蚀时，小型发酵罐通常采用不锈钢制造。对于大型发酵罐，为了节约不锈钢材料起见，一般都采用不锈钢衬里的方法，即在碳钢制造的壳体内加衬一层薄的不锈钢板(厚约1~3毫米)。如果不锈钢衬里加工焊接不善，在钢板和焊缝处有裂缝，或在操作时不注意，使不锈钢皮鼓起后产生裂缝，发酵液就会通过裂缝进入衬里和钢板之间，窝藏在里面形成死角(图7~12)。不锈钢皮怎样会鼓起的呢？因为作为衬里的不锈钢皮较薄，在培养液分批灭菌或空罐灭菌时，发酵罐经加热后再行冷却，如果此时不及时通入无菌空气保持一定压力，那末会因蒸汽的突然冷凝体积减小而形成真空将衬里吸出，严重者造成破裂。所以对于不锈钢衬里设备加工时应该尽可能增加衬里的刚度，其办法是每隔一定距离用点焊增加衬里与钢制壳体的连接强度，减少鼓起的可能性。操作时要注意避免罐内发生真空现象。发生这种事故后，如衬里钢板尚未破裂可用罐内加水压的方法将其恢复原状(水的压力不应超过设备的允许使用压力)，应尽可能避免锤击，用锤击的方法使钢板受力不匀易造成破损。衬里与外壳之间的夹层中可用水压或气压方法检查其是否渗漏。
采用复合钢板(将两种不同材质的钢板轧合为一体的钢板)制造发酵罐，因为两层钢板紧密结合在一起，中间没有空隙，所以不会产生上述问题，是一种理想的材料。

4，接种管路的死角
接种一般采用以下两种方法：
(1)压差接种法。存种子的血清瓶上装有橡皮管，在火封下与罐的接种口相连接，利用两者的压力差使种子进入罐内，要求瓶与橡皮管的连接不漏，橡皮管与接种口的大小一致。
(2)微孔接种法。利用注射器在罐的接种口橡皮膜上注入罐内进行接种，在操作时要注意防止注射器针孔堵塞。

采用种子罐时是利用压力差将种子罐中培养好的种子输入发酵罐内，种子罐与发酵罐的一段连接管路的灭菌是与发酵罐的灭菌同时进行的。如图7-13a所示有一小段管路存在蒸汽不流通的死角，所以应在阀2的半截上装设旁通，焊上一个小的放气阀，如图7-13b所示，此段管路即可得到蒸汽的充分灭菌。
5，排气管的死角
罐顶排气管弯头处如有堆积物，其中窝藏的杂菌不容易彻底消灭，而当发酵时受搅拌的震动和排气的冲击就会一点点地剥落下来造成污染。另外排气管的直径太大，灭菌时蒸汽流速小也会使管中部分耐热菌不能全部杀死。有的单位曾作过试验，将排气管做成每节可拆卸的，灭菌后将各节拆下分别检查就发现某些末被杀死的耐热菌。所以排气管要与罐的尺寸有一定比例，不宜过大或过小。
6，不合理补料管配置造成的死角
7，压力表安装不合理形成的死角
三、空气过滤器
工业用的空气除菌系统中的空气过滤器一般都比较庞大，如果其中的纤维铺设不匀，密的部分阻力大，松的部分阻力小，就会使较多的空气沿着阻力小的部分流出，从而形成短路。走短路的那部分空气没有经过充分过滤而带菌，进入发酵罐将使发酵染菌。纤维层装得太松对过滤不利，太紧同样也会影响过滤效率。同时，在过滤介质用蒸汽灭菌时，太紧则蒸汽穿透力差，穿透力差灭菌效果也差。所以用过分压实纤维层的办法试图达到增加过滤效率的目的，实际上是适得其反。对于棉花过滤器最合适的充填密度是160~180公斤／米3；玻璃纤维是130~180公斤／米3左右。在铺纤维时分层均匀铺设是必要的。
过滤器器壁腐蚀形成氧化铁层，氧化铁是一种多孔物质，空气会在其中穿过而得不到过滤，因而也会使空气中带茵并造成污染。
采用活性炭棉花作为过滤介质的空气过滤器，活性炭受到气流的冲击互相碰撞、摩擦而破碎并逐渐灰化，使活性炭的体积减小空间增大，上下两端的棉花受空气的顶撞力而逐渐改变位置(见图7-14)。之后，灰化的活性炭随气流逸出，整个过滤介质的体积减小使过滤层倾斜甚至发生翻身的现象，致使大量未经过滤的空气进入发酵罐内造成严重的染菌事故。 在用蒸汽灭菌时，检查排出蒸汽的情况可以判断过滤层是否有问题。排出蒸汽均匀并呈青色有力表示情况良好，排出蒸汽呈雾状无力表明压得太紧，而当排出蒸汽断续不均匀以及进出口两测的压力降过小时则就有可能是过滤层有位移现象，发现不正常的情况应立即予以纠正。

不论采用何种过滤介质，必须保持其干燥，油水分离的清净与否是保证过滤效果和延长使用寿命的关键因素。要根据发酵的特点和要求选用合理的空气流程并选用高效的气液分离设备(如气液过滤网)。采用吸湿的办法不是好办法，因为吸湿材料使用一定时间后要进行脱湿，增加操作管理费用，而当空气中湿度增高时就难以保证达到使空气干燥的要求。
大多数产品在整个发酵期间需要改变空气流量，但油水分离设备、过滤器的过滤面积和长度是根据空气流速来设计的，空气流速的改变就会影响油水分离效果和过滤效率，所以设计时要充分注意这种情况，掌握空气流量改变的范围，选择合适的空气流速。生产时各罐的发酵时间要尽量叉开，使空气流量均匀。
过滤器灭菌用的蒸汽阀的微小渗漏会使蒸汽管路中的冷凝水抽吸到过滤器内使过滤介质受潮，影响过滤效果，所以最好装设双重阀以防渗漏。
发酵罐在灭菌和发酵时，如操作不当使罐压高于过滤器中空气的压力，就会将冷凝水或发酵液倒灌至过滤器内。如为冷凝水将使介质受潮，如为发酵液则过滤介质被浸透结成硬块使过滤器失效。当突然停电时，空压机停止运转也会发生倒灌的情况。
超细玻璃纤维纸的周围密封要可靠，空气阀和蒸汽阀要缓开缓闭，避免因流速突然升高将过滤纸击穿。
空气系统所有的设备要定时打开排液阀排液，避免设备内积液太多而带入空气中去。
进年大部分通风发酵工程均采用膜过滤器取代传统的棉花过滤器，上述问题已得到很好的解决。

四、灭菌操作中的有关问题
1，蒸汽和灭菌操作
罐压1公升/厘米2，料温120℃并维持一定时间是一般实罐灭菌(即培养基的分批灭菌)的操作规范。根据操作经验，能否达到彻底灭菌的目的在于罐内压力能否控制得与应该达到的温度相对应，例如罐压已达到1公斤/厘米2而料温却并未达到120℃，则某些耐热的细菌芽孢就难以完全杀死。产生罐压和料温不相对应的情况是由于操作不合理所致，例如在灭菌开始时没有将罐内冷空气排除干净，蒸汽中掺入了冷空气使蒸汽的分压降低，蒸汽压力实际上没有达到1公斤/厘米2因而料温也就达不到120℃。
为了加快加热时间，凡能进蒸汽的管路在灭菌时都可同时进汽，但各管路的阻力不同，大量蒸汽从阻力小的进汽管中冲入罐内，这是一种蒸汽短路现象，使物料受热不匀，部分培养液过热而部分培养液则可能灭菌不透，尤其是罐底的空气分布管是主要的进汽口，但由于液柱压力较大，阻力就比其他进口大，所以在灭菌操作时应将空气分布管的进口阀门开得比其他进气口的阀门大一些，以保证有足够的蒸汽从空气分布管进入，促使培养液激烈翻动起搅拌混和作用。
灭菌蒸汽要求采用饱和蒸汽，冷凝水越少越好，冷凝水多，热量的穿透力就差，在冷凝水较多或蒸汽管道较长的情况下，蒸汽进车间后的总管上要装设汽水分离装置将冷凝水分离后再使用。总之，灭菌时蒸汽压力要求平稳，在压力变动较大时，操作人员需灵活掌握加以控制。
2，泡沫问题
培养基中含有较多量的黄豆饼粉、花生粉或蛋白胨等成分时，在灭菌时这种培养基就容易产生泡沫，发生泡沫的温度约为90℃左右。泡沫严重时会上升到罐顶甚至逃液，此时操作就比较困难。实践证明：灭菌时泡沫严重的，就不易灭透。所以在发生泡沫时应加以清除(加消泡剂和在操作上予以控制)。
发生泡沫的培养基灭菌不透的原因可能是由于某些耐热细菌潜伏在泡沫里，泡沫中的空气和泡沫的薄膜有隔热作用，热量不易穿透进去杀死其中潜伏的菌，一旦泡沫破裂，这些菌就被释出造成污染。
3，其他操作问题
实罐灭菌时，当经过加热和维持时间后开始冷却，此时可能因蒸汽冷凝而使罐压突然降低甚至会形成真空，所以此时必须将无菌空气通入罐内保持一定压力，并注意压力变化，随时进行调节。
对于中小型发酵罐，一般经空罐灭菌(1.5公斤/厘米2，15分钟)后再将培养基放入罐内进行实罐灭菌。有些工厂为了节约蒸汽，直接进行实罐灭菌而不进行空罐灭菌，他们只有在检修后或在节日停工后以及春夏季节发酵罐空置了24小时以上时才进行空罐灭菌。这种方法如果操作上注意是完全可行的，也是一种节约燃料的有效措施。
大型发酵罐大多采用连续灭菌，这时空罐需先行灭菌。但也有在发酵完毕后，将空罐保压不灭菌就进连消好的培养基，这要根据各厂的生产菌株特性和生产设备等具体情况而定。对于发酵周期短的菌株、突变影响小的发酵，采用保压不进行空罐灭菌的办法是可行的，但经一定发酵批数后仍需定期进行空罐灭菌，否则较难避免杂茵污染与遗传突变的影响。

六、染菌后的挽救措施
为了减少损失，对被污染的发酵液要根据具体情况采取不同的挽救措施。
如果种子培养或种子罐中发现污染，则这批种子就不能再继续扩大培养，因为此时的损失毕竟是很小的。
发酵早期染菌可以适当添加营养物质，重新灭菌后再接种发酵。中后期染菌，如果杂菌的生长将影响发酵的正常进行或影响产物的提取时，应该提早放罐。但有些发酵染菌后发酵液中的碳、氮源还较多，如果提早放罐，这些物质会影响后处理提取使产品取不出，此时应先设法使碳、氮源消耗，再放罐提取。
在染菌的发酵液内添加抑菌剂(如小剂量的抗菌素或醛类)用以抑制杂菌的生长也是一种办法。抑菌剂要事先经过试验，确实证明不妨碍生产菌的生长和发酵才能使用。 因而不是所有发酵都能使用抑菌剂。另外，采用加大接种量的办法，使生产菌的生长占绝对优势排挤和压倒杂茵的繁殖，也是一个有效的措施。还有将种子罐中种子培养好后，进行冷冻保压(1.5公斤/厘米2，10℃左右)，经平板检查证明无杂菌后，再接入发酵罐发酵，这一措施在一些谷氨酸发酵生产工厂取得很好效果。
有时发酵罐偶而染菌，原因一时又找不出，一般可以采取以下措施：
(1)连续灭菌系统前的料液贮罐在每年4~10月份(杂菌较旺盛生长的时间)加入0.2%甲醛，加热至80℃，存放处理4小时，以减少带入培养液中的杂菌数。
(2)对染菌的罐，在培养液灭菌前先加甲醛进行空消处理。甲醛用量每立方米罐的体积0.12~0.17升。
(3)对染菌的种子罐可在罐内放水后进行灭菌，灭菌后水量占罐体的三分之二以上。这是因为细菌芽孢较耐干热而不耐湿热的缘故。

第五节 噬菌体感染和处理方法
利用细菌或放线菌进行的发酵容易感染噬菌体。噬菌体是病毒的一种，直径约0．1微米，可以通过细菌过滤器，所以通用的空气过滤器不易将其除去。设备的渗漏、空气系统、培养基灭菌不彻底都可能是噬菌体感染的途径。如果车间环境中存在噬菌体就很难防止不被感染，只有不让噬菌体在周围环境中繁殖，才是彻底防止它污染的最好办法。因为噬菌体是专一性的活菌寄生体，不能脱离寄主自行生长繁殖，如果不让活的生产菌在环境中生长蔓延也就堵塞了噬茵体的滋生场地和繁殖条件。通常在工厂投入生产的初期噬菌体的危害并不严重，在以后生产中，由于人们不注意，在各阶段操作中将活的生产菌散失在生产场所和下水道等处，促成噬菌体的繁殖和变异，随着空气和尘埃的传播而潜入生产的各个环节中。为了不让活的生产菌逃出，发酵罐的排气管要用汽封或引入药液(如高锰酸钾、漂白粉或石灰水等溶液)槽中，取样、洗罐或倒罐的带菌液体要处理后才允许排入下水道。同时要把好种子关，实现严格的无菌操作，搞好生产场地的环境卫生。车间四周要经常进行检查，如发现噬菌体即时用药液喷洒。
如已感染噬菌体可采用以下处理方法：
1)选育抗性菌株。 
2)轮换使用专一性不同的菌株。
3)加化学药物(如谷氨酸发酵可加2~4ppm氯霉素，0.1%三聚磷酸钠，0.6%柠檬酸钠或铵等)。
4)将培养液重新灭菌再接种(噬菌体不耐热，70~80℃经5分钟即可杀死)。
5)其他方法。如谷氨酸发酵在初期感染噬茵体，可以利用噬菌体只能在生长阶段的细胞(即幼龄细胞)中繁殖的特点，将发酵正常并已培养了16~18小时(此时菌体己生长好并肯定不染菌)的发酵液加入感染噬菌体的发酵液中，以等体积混合后再分开发酵。实践证明，在谷氨酸发酵中，采用这个方法可获得较好的效果。