基因治疗经历30年的挫折后，目前正在迅速发展，成为治疗人类各种遗传性和获得性疾病的关键组成部分。基因治疗遗传性免疫系统疾病、血友病、眼睛和神经退行性疾病，给人类带来了很大的希望。
1月12日，《Science》杂志发表了基因治疗最新综述，讨论了基因治疗发展中的里程碑，突出阐述了为基因治疗领域的成功奠定基础的关键发展，侧重于体内治疗的病毒载体和基因工程T细胞或造血干细胞的移植；同时，研究了将来有可能改变基因疗法的靶向基因组编辑的最新进展。
基因疗法为多种医学领域带来新的治疗选择。四十五年前，Theodore Friedmann提出了用基因疗法治疗遗传病的潜力和挑战的预言（1）。人类对基因治疗兴趣的日益增长，至少在理论上承认：单一治疗可能实现持久的、潜在的临床治效。
研究人员推测，与蛋白质类药物需要反复输注相比，基因治疗输注长寿命细胞可能会持续产生内源性蛋白质，例如血友病的凝血因子（2）。例如，转基因造血干细胞（HSC）可以持久缓解的条件范围内，避免终生服用酶或输血治疗（3,4）。
最初，基因治疗被认为是一种治疗遗传性疾病的方法。现在，基因治疗正被应用于后天性疾病，基因工程T细胞用于治疗癌症是最好例证。最近的临床研究发现，单次输注嵌合抗原受体T细胞可以在一个亚群的患者中产生持久的反应（5）。
将基因治疗的概念转化为临床治疗，始于上世纪90年代初期，但由于反复的乐观情绪和令人失望的临床试验结果而饱受折磨。一些早期的临床试验发现，没有疗效或产生意外的毒性导致某些病例死亡，而被广泛宣传（6）。1996，美国国立卫生研究院（NIH）咨询小组得出结论，这些令人失望的临床结果是由于对病毒载体、靶细胞和组织以及疾病的认识不足造成的。咨询小组建议研究人员重返实验室，关注基因治疗方法的基础科学研究（7）。新载体的开发和对靶细胞的进一步了解，引发了20世纪90年代末和21世纪初的第二代临床试验。这些试验证明，在某些情况下，靶组织持续的基因修饰可以获得临床获益。然而，由于基因转移效率高导致的严重毒性，使基因治疗的进步再次放缓；例如：插入基因毒性，转基因细胞的免疫破坏，某些载体相关的免疫反应（6, 8, 9）。
在过去的10年中，基因治疗在“科学”研究、安全性的改进，基因转移效率和输注的进一步成熟，最终推动了大量的临床进展。美国和世界各地的监管机构，已经批准一些基因和基因修饰的细胞疗法成为药物，还有十多项获得了“突破疗法”称号。
基因工程从病毒载体到基因组编辑
重组、复制缺陷型病毒载体是第一个有效、无毒的基因转移到人体细胞的分子工具（10）。逆转录病毒和腺相关病毒（AAV）最有临床前景，我们的仅讨论这些载体。
逆转录病毒载体
基因组包装信号（11）的识别和产品细胞系（12）的建立，为设计和生产能够进行反转录和DNA整合，同时缺乏复制潜力的载体，铺平了道路（13, 14）。二十世纪80年和90年代早期，证明开发的g型-逆转录病毒载体可以将基因导入再生的造血干细胞（15-17）。C型-逆转录病毒可以将有效的基因导入原始T淋巴细胞（18-21）。第一代的临床试验设计使用这些载体，转移一个特定的缺陷基因进入免疫缺陷病或癌症患者的T细胞或造血干细胞的基因组，（reviewed in (22)）（图1）。
图1。造血干细胞基因治疗的历史回顾。HSCT: 造血干细胞移植；HSC: 造血干细胞；SCID: 重症联合免疫缺陷；NHP：非人灵长类动物；ZFN:锌指核酸酶；TALEN: 转录激活因子样效应物核酸酶；CRISPR / Cas9：规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）–CRISPR相关9（cas9）核酸酶。
随后，两个其他属的逆转录病毒加入到载体系列：慢病毒（lentiviruses）（23）和泡沫病毒（spumaviruses）（24）。与g型-逆转录病毒载体不同，慢病毒载体可以将基因导入处于不分裂的G0期的静止细胞（25）。慢病毒载体可以携带更大更复杂的基因盒，因此，它们为血红蛋白病的治疗提供了重要进展（26）。慢病毒载体和泡沫病毒载体的另一个优点，它们优先整合到基因的编码区。相比之下，g型-逆转录病毒载体，可以整合到基因5′-非翻译区（27），增加了造血细胞致癌基因插入突变的潜在风险（28）。Lentiviruses载体是目前大多数造血干细胞应用的首选工具，但g-retroviral载体仍然是用于工程T细胞和造血干细胞基因治疗某些应用（表1）。使用“自我失活的SIN设计，去除慢病毒载体和g-retroviral载体的内源性强增强子元件，是降低遗传毒性的风险的另一种方法（30）；目前大多数临床试验采用这种设计（表1）。对整合型逆转录病毒载体进行详细的综述（31, 32）。
腺相关病毒（AAV）载体
AAV载体来自于一种非致病性，无包膜的细小病毒，天然具有复制缺陷。野生型AAV需要另一种病毒，如腺病毒或疱疹病毒，完成复制（33, 34）。AAV s病毒载体的所有编码序列可以由一个感兴趣的基因表达盒的替代。AAV载体的一个限制是，不能容纳超过5 kb的DNA（g-retroviral或慢病毒载体，可容纳>8 kb DNA）。AAV载体主要是非整合性型；转移的DNA作为游离基因是稳定。这一特点降低了整合风险，也限制了腺相关病毒载体在有丝分裂后细胞内的长期表达。
在20世纪90年代中期，两个研究小组证实，小鼠肌肉注射AAV载体后，转入的基因在小鼠体内长期表达（35, 36）。这一开创性的工作证实，在动物模型中，AAV载体可以有效地转染各种靶组织，包括肝脏、视网膜、心肌和中枢神经系统，具有特定的组织感染倾向，发现天然存在的AAV血清型和具有优化外壳的AAV工程型（37）。综述改进AAV载体制造技术（38），增加AAV载体产量和产品纯度，大动物疾病模型上进行概念论证研究（图2）。上世纪90年代末，启动了开创性的AAV基因治疗B型血友病的临床试验，首先测试AAV载体肌肉注射（39），然后静脉注射，利用AAV2的肝脏倾向（40）。这些早期的实验建立了安全的但剂量不足治疗，并出现抗AAV的免疫反应，最有可能的原因是，很多人携带了针对病毒衣壳的中和抗体和记忆性T细胞。如下面所述，充分利用AAV载体的治疗潜力，需要严格分析抗AAV免疫反应（41），包括针对一系列血清型AAV载体的细胞和体液反应（42）。
图2. AAV基因治疗血友病的历史回顾。AAV：腺相关病毒载体；FVIII：VIII因子；FIX：IX因子；Mfg：制造业。
基因组编辑
与病毒载体仅可以介导一种基因修饰（“基因添加”）不同，新的基因组编辑技术可以介导基因添加、基因删除、基因校正，以及细胞内其他高度靶向的基因组修饰。基因组编辑可以在体外细胞上进行，也可以在体内进行原位基因组编辑。靶向DNA替代是由一个核酸酶诱导双链DNA断裂引发（DSB），可以激活哺乳动物细胞中的高效重组（43）。非同源末端连接（NHEJ）–介导的修复，可以在DSB位点有效的产生不同长度的插入片段或删除突变（InDel），通常导致基因功能失活。同源定向修复（HDR），在同源供体DNA模板的存在下产生特定的替代序列，重组后在特定位点纠正突变或插入新序列（44）。
早期的基因组编辑研究，依赖于特定的锌指核酸酶（ZFN）（45）或超级核酸酶（46），在DNA靶位点诱导所需的DNA双链断裂（DSBs）。这些核酸酶平台需要专门的知识，定制特异的结合核酸酶效应蛋白切割靶DNA，这限制了锌指核酸酶的广泛应用。2009年证实，细菌蛋白的DNA结合区称为转录激活效应区（TALEs）很容易改变（47, 48），为产生TALE核酸酶（TALENs）打开创造之门（49, 50）。这些酶能有效地切割任何感兴趣的DNA序列（51）。然而，TALEN的方法仍然需要为每个新的靶向DNA设计两条特定的核酸酶。
2012年，基因组编辑发生巨大的改变， Doudna和Charpentier开创性的发现，细菌防御系统由成簇规律间隔短回文重复（CRISPR）–CRISPR 相关核酸酶9（cas9），CRISPR- Cas9核酸酶可以有效地、程序性切割DNA位点，只需设计一条与感兴趣的目标位点互补的、特定的、短链指导RNA（gRNA）（52）。CRISPR-Cas9核酸酶技术迅速扩展到哺乳动物细胞（53, 54），从而简化基因组编辑过程（55）。TALENs和CRISPR-Cas9核酸酶，可以很容易地重编程切割特定的DNA序列，现在广泛用于无数的基础研究中（56-58）。一些最终可以应用于临床的聪明策略，涉及使用RNA引导的催化Cas9活性（“死亡Cas9”或dcas9），通过阻断转录机制或招募表观遗传调控因子来打开和关闭基因（59, 60）。最近报道，在单碱基水平校正突变针对Cas9 -为基础的“基础编辑”（61, 62）。
基因组编辑方法为纠正或改变基因组提供了一个精确的手术刀，可以克服依赖于病毒载体介导的半随机基因组插入策略的许多缺点。例如，基因毒性由于邻近的原癌基因的异位激活、肿瘤抑制基因的敲除或正常剪接的紊乱，基因突变不应发生在靶基因编辑。此外，外源基因/校正基因将受内源启动子的调控，导致更多的生理调控基因表达（63）。肝细胞中高活性白蛋白启动子下游靶向引入凝血因子基因，在动物模型中看到希望（64）。基因组编辑策略的潜力，通过可变剪切突变的肌营养不良蛋白基因，或直接纠正肌营养不良蛋白突变，绕过肌营养不良症的病理学，已经在临床前模型中得到证实（65-67）。最后，由于显性失活突变所引起的疾病，不能通过基因添加来治疗，因此应服从基因校正策略。
将基因编辑所需的所有组件输送到细胞内存在挑战。NHEJ导致的基因突变最简单，只需要靶向核酸酶，超级核酸酶，ZFN，或TALEN技术，或核酸酶加gRNA的CRISPR方法；这些组件可以通过非整合病毒载体或转染mRNA或RNA蛋白质复合物进入靶细胞，如体外的造血干细胞。然而，通过HDR的基因校正需要供体DNA，输送更加困难，HDR似乎在某些静止的细胞类型如长期再植造血干细胞是无效的（68, 69），虽然正在取得进展（70）。
基因组编辑作为一种治疗手段正在迅速发展到临床（表1）。ZFN已经用于破坏在人类T细胞（71）和HSCs（72）中的表达的CCR5（C-C类趋化因子受体5型）基因，这些细胞可以对抗HIV感染。I / II期T细胞CCR5编辑研究已经完成（73），I期临床试验HSC编辑正在进行中（NCT02500849）。TALENs已经用于制造“现成的”第三方抗-CD19嵌合抗原受体（CAR）的T细胞，不太可能导致移植物抗宿主病（GVHD）。这是由T细胞受体基因缺失引起的。这些修改后的细胞治疗2例难治性急性B细胞白血病，肿瘤反应的证据（74），正在进行I期临床试验（NCT02808442）。此外，早期的试验已经开始，异体TALEN编辑CAR T细胞靶向CD123，治疗急性髓系细胞白血病和急浆细胞样树突状细胞肿瘤（NCT03190278）。FDA批准ZFN介导的、体内插入肝细胞白蛋白基因的三项基因治疗临床试验的启动：提供B型血友病凝血因子IX基因（NCT02695160），粘多糖贮积症I，a- L -iduronidase基因（NCT02702115），粘多糖贮积症II a- L - iduronidate-2-硫酸酯酶基因（MPSII）（NCT03041324）。第一个病人通过体内基因组编辑，最近参加了MPS II试验，编辑组件通过AAV载体静脉输液到肝脏。中国监管机构的至少已经批准9个使用CRISPR-Cas核酸酶临床试验，主要是为了在肿瘤靶向T细胞中敲除PD1的表达，据报道，已经有几位患者入组。
与标准的基因转移方法相比，基因组编辑特别是基于CRISPR-Cas核酸酶的基因编辑，正处于转化和临床初级阶段。一些潜在的可行性和安全性的障碍，可能影响临床应用；这些都需要在适当的模型上进行深入的临床前研究和精心设计的临床试验。例如，在替代位点，由于核酸酶介导的NHEJ或HDR，“脱靶”突变的程度正在进行紧张的研究。相关的研究问题，如何设计最优的核酸酶或CRISPR gRNAs，避免脱靶切割？临床应用之前或应用期间，如何预测、筛选、检测基因组中靶和脱靶（75）？值得注意的是，最近已研发出没有或很少检出的脱靶效应的高保真CRISPR-Cas9核酸酶（76-78）。体内的基因组编辑核酸酶的免疫原性仍然存在问题，为了保证基因编辑组织的靶向性，要进行靶向传输。
CAR疗法
工程T细胞正在成为强有力的癌症药物（图3）（5）。嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptors，CARs)是人工合成的基因工程受体，抗原，在一个单一的分子中整合了T淋巴细胞的特异性、功能和代谢（124, 125）。CAR由抗原结合结构域，来自于一个免疫球蛋白分子或一个T细胞受体，融合为一个细胞内信号转导结构域，介导激活和共刺激以增强T细胞功能和持久性。与抗原的生理受体不同，CARs可以被工程化设计，识别蛋白质和碳水化合物的糖脂，以及HLA多肽复合物（126, 127）。体外，CARs转染进入T细胞，从而产生可扩增的抗原特异性T细胞。激活内源性T细胞的主动免疫屏障和增加动力学。CAR-T细胞的生成需要稳定的基因转染，确保CAR在分裂和稳定的T细胞中持续表达。
图3.CAR-T细胞疗法的历史回顾。CAR：嵌合抗原受体；cGMP：现行良好制造规范；DLI: 供体白细胞输注；LAK: 淋巴因子激活的杀伤细胞；Mfg：制造业；NK:自然杀伤细胞；TIL：肿瘤浸润淋巴细胞。
g-retroviral载体原本是用来证明CARs针对CD19，在大多数 B细胞淋巴瘤和白血病发现的细胞表面抗原，可以消除免疫缺陷小鼠体内肿瘤（128）。目前，CD19是最常见的CAR的靶标，成为CAR治疗模式（图3）。难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL），慢性淋巴细胞白血病，成人和儿童急性淋巴细胞白血病（ALL），已得到持久的反应（见表1）。总的来说，对CD19 CARs的临床前和临床研究采用不同的载体系统（慢病毒载体，转座子，mRNA，CRISPR-Cas9）（129），CARs设计（130, 131），与T细胞亚群（132, 133），已经验证了CARs的概念（5, 126）。值得注意的是，CAR-T细胞治疗，伴随严重的全身毒性，往往需要重症监护，在某些情况下造成病人死亡。研究人员正在集中精力更好地理解，减轻和治疗这些并发症，其中包括肿瘤脱靶作用及细胞因子释放综合征（CRS），以及了解甚少的神经毒性（134, 135）。
CD19 CARs在难治性ALL和难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）临床受益， 2017 年，FDA批准两个基因工程细胞的产品，是美国首次批准。其他几家CARs获得了FDA治疗B细胞恶性肿瘤的突破性疗法（表1）。CAR治疗多发性骨髓瘤的早期临床数据也是令人鼓舞的（136）。目前的研究目标是将CAR治疗扩大到髓系恶性肿瘤和实体瘤（137, 138）。这些疾病带来了挑战，因为可靠的肿瘤特异性细胞表面抗原尚未得到验证。此外，需要一个方法，有助于CAR-T细胞进入较大肿瘤或免疫特权区域，克服肿瘤微环境信号。通用第三方CAR-T细胞，可以使用“现成的”CAR-T细胞，与患者的自身特异性T细胞相比，将提供更快速和更便宜的治疗。T细胞缺乏内源性T细胞受体和/或主要组织相容性复合体分子，以减少GVHD和排斥的风险，在临床前或早期临床研究，作为迈向这一目标的第一步（62, 73）。CAR-T细胞已经对某些癌症治疗具有很大的影响（139），这一成功为未来T细胞为基础的治疗其他癌症和其他疾病如自身免疫性疾病和艾滋病的治疗（5, 140），提供了基础。
结论
根据概念验证的临床研究证明治疗有效，基因疗法目前正在加速临床转化和商业发展。然而，未来仍有很多挑战，包括解决整合基因载体的遗传毒性或关闭靶向基因组编辑，提高基因转移水平或基因组编辑效率，解决体内对载体的免疫反应，并对如基因组编辑的伦理争议和昂贵的治疗费用等问题达成社会共识等。
学术界和工业界的研究人员正在与监管机构和实体合作，开发和标准化用于分析测定载体制剂的效力和安全性及产品放行标准；基因编辑的科学进步也不断涌现，正在加速未来的临床转化和商业化开发。未来，基因治疗的新付款模式也将成为研究重点。
科学家和临床医生从事基础、转化和临床研究的工作，在政府和慈善机构的支持下，创新技术或改进技术将不断涌现。人类有理由保持乐观和继续努力，基因治疗将成为人类严重疾病的重要治疗手段。
备注：文中所标注的参考文献，详细信息可查阅综述原文《Genetherapy comes of age》
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