四川农业大学 蒲至恩
各位老师好，我是四川农业大学蒲至恩，代表“一麦众承”10组“麦陇和风”值日。我们组长是泰安市农业科学院小麦研究所钱兆国所长，组员赵岩、张勇、王玉玲、王怀平、曾潮武、王二伟、尹志刚、张磊、薄至恩、周振华、冯朝旭、王世红、王财秀、张雪婷、刘自成、王丹、王稳江、崔同霞、姚方杰、刘鹏、蒋少威老师。感谢“一麦众承”平台提供的交流学习机会。
不断出现的极端天气将使人类在粮食生产过程中面临前所未有的逆境，而靠天吃饭的非灌溉区农业受到的冲击最大（王宏广，2020）。种子是农业的“芯片”，其中高活力种子出苗快和整齐，幼苗健壮，具有显著的生长优势和生产潜力，是应对生产逆境，保障粮食高产的重要基础，但种子在存放过程中活力会逐渐下降，造成萌发能力下降、营养物质流失、活力和品质状况变差。
西南地区主要为麦-稻两熟连作区，种植小麦的土壤为稻田土，其质地黏重、排水能力差，在播种季节遇雨则易积水，造成小麦种子播后渍水闷种而死亡从而造成缺苗断垄，最终影响产量。解决这一实际情况最经济有效的措施是播种高活力小麦品种，因此筛选高活力小麦种质资源研究小麦高种子活力的形成机制，能为提高小麦高种子活力品种的选育提供新资源和新思路。
种子活力是种子的生物学属性，它表明种子是否能够在适宜的条件下迅速发芽并形成健康的幼苗。具有高种子活力的种子通常表现出较高的发芽率和较快的发芽速度，从而提供了更好的生长起点。种子活力受基因型和环境两方面的影响。与种子活力相关的QTLs在农作物上也被陆续发现。近年来，在拟南芥、水稻、油菜等的种子活力性状数量性状（QTL）分析方面已有大量报道]。Li利用Japonica Daguandao和iwcfca IR28两个品种的重组自交系（RIL）群体定位了10个同水稻种子活力相关的QTLs，经研究得出该QTLs与种子重量、种子形态等性状具有较高的联系。Zhang等利用Lemont和Teqing构建的264个家系的RIL群体，共定位到13个控制水稻种子活力相关性状的主效QTL和19对上位性QTL。Han等利用两个相关的RIL群体，在4种处理下，对玉米种子活力相关性状进行QTL定位分析，两个群体共检测到65个QTL，用Meta分析整理遗传图谱，将61个初始QTL被整合为18个mQTL(meta-QTL)。但是，关于小麦种子活力的QTL定位报道较少，主要集中在种子萌发、幼苗生长、种子寿命和幼苗对胁迫的耐受性上。Spielmyer等在小麦6B染色体上检测到1个与胚芽鞘、种子活力和株高相关的QTL，研究发现该QTL对胚芽鞘增长、叶片增宽等有促进作用。薛小雁等以中国春和西农817两个品种的重组自交系（RIL）群体定位了与小麦种子发芽率、电导率等相关的QTLs，共检测到28个QTL位点，分布在1A、4A、7A、3B、4B、7B、6D和7D 8条染色体上，贡献率范围为0.8317%-13.9878%。与CK发芽势、老化发芽势、相对发芽势、CK发芽率、老化发芽率、相对发芽率、CK电导率、老化电导率以及相对电导率相关的QTL位点数分别为4、3、4、5、3、3、2、3、1个。目前小麦种子活力的相关QTL位点报道较少。
本项目对种植于3个环境下的遗传背景广泛的406份世界小麦，采用4种测定种子活力的方法，测定16个种子活力的相关指标，分析种子活力与各指标之间的相关性，筛选出高、低活力的小麦品种，并结合高通量 Wheat660K SNP芯片上的标记，对406份材料构成的自然群体进行全基因组关联分析，筛选与种子活力相关的显著SNP标记及稳定的QTL区段，预测候选基因，可为各地育种提供重要的参考依据，为小麦改良提供新的基因资源。
2材料与方法
2.1试验材料与试验设计
本研究406份小麦，分别于2019年和2020年在雅安和崇州两地进行田间试验，将种植环境定义为E1（2019年雅安）、E2（2019年崇州）和E3（2020年崇州）。种植方式为3行种植，行长2 m，行距0.3 m，每行播种约20粒。材料完熟期进行收获。田间管理按当地小麦产量比较试验进行。
2.2 表型测定
2. 2.1标准发芽试验
依据农作物检验规程(GB/T 3543.4-1995)标准发芽试验法。
2. 2.2人工加速老化试验
取10 g小麦种子，将消毒后的种子平铺于老化盒网架后置于温度41℃、湿度95%的光照培养箱中老化72 h，老化结束后进行标准发芽试验。
2.3表型数据处理
使用Office 2019对406份小麦的表型数据进行初步整理，利用SPSS 26.0软件进行描述性统计、方差分析、相关性分析和主成分分析，用Origin 2021进行图的绘制。
2.4全基因组关联分析及候选基因预测
2.4.1群体遗传结构、多样性和连锁不平衡分析
Structure V2.3.4用于本文的群体结构分析，采用一般线性模型，基于Bayes数学模型进行来群划分。利用PowerMarker V3.25统计最小等位基因频率、等位基因数和遗传多样性；利用Tassel V4.0软件对世界小麦地方品种连锁不平衡和显著(P<0.00l) SNP位点进行评估。
2.4.2候选基因预测
根据GWAS分析结果重点筛选活力指数、老化活力指数电导率的稳定QTL位点，根据位点信息，在中国春1.0基因组（http://wheatomics.sdau.edu.cn/jbrowse-1.12.3-release/?data=Chinese_Spring1.0）中查询稳定标记区间内的候选基因。根据筛选到的候选基因，结合基因功能注释，根据注释信息找出与性状相关的候选基因。
3结果与分析
3.1不同测定方法对小麦种子活力的评价分析
3.1.1 标准发芽试验下种子活力指标的变异分析
对标准发芽试验下的6个指标进行方差分析（表1），结果表明：发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、根长、苗长受环境的影响达极显著水平，受品种影响达显著水平。发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、根长、苗长符合正态分布，可进行后续关联分析。标准发芽试验下种子活力相关性状的变异系数位于7.31-22.66 %之间，其中活力指数的变异系数最大，发芽率变异系数最小，表明了在标准发芽试验下各活力性状的变异程度不同。在标准发芽试验下，三环境中种子活力相关性状的均值E1＞E3＞E2。
3.1.2人工加速老化试验下种子活力指标的变异分析
人工加速老化试验下的方差分析（表2）表明人工加速老化试验下较标准发芽试验下种子活力相关性状的变异系数高，表明了人工加速老化处理后的发芽试验比标准发芽试验下能更好地反映小麦种子活力性状的差异。
3.2基于聚类分析对种子活力的综合评价
利用平方欧氏距离、类平均法，对电导率、标准发芽试验下的发芽势、发芽指数和活力指数、根长、苗长，人工加速老化试验下的发芽势、发芽指数、活力指数、根长、苗长综合指标对小麦种子活力进行聚类分析（图1），结果可知：当阈值为45时，世界小麦分为高活力和低活力2类。第Ⅰ类小麦品种的电导率均值为20.32，大于第Ⅱ类19.02，而电导率越大，种子活力越低。第Ⅰ类小麦品种的发芽试验各指标均低于第Ⅱ类小麦品种，其中老化活力指数21.48，远小于第Ⅱ类的57.35。而发芽试验下各指标越大，种子活力越高。因此，第Ⅰ类为低活力小麦品种，第Ⅱ类为高活力小麦品种。低活力小麦品种共有257份，占供试材料的63%。
3.3基因型数据分析
3.3.1遗传多样性分析
利用小麦 Wheat660K 芯片数据对406份小麦进行测序，结果显示SNP共有140627个，使用TASSEL V5.0软件对SNP进行过滤筛选，以缺失率 ≤ 10%和最小等位基因频率（MAF）≥0.05为标准，筛选后SNP标记共有139601个用于后续分析。根据SNP密度分布图（图2）可知：标记是非均匀分布的，但覆盖较广。根据SNP在染色体上的分布图（图3）可知：这些SNP标记分布在21条染色体上，B基因组分布标记最多，为68936个，D基因组分布最少，为12844个，2号同源群分布标记最多，为24757个，4号同源群分布标记最少，为13193个。
3.5.2群体结构分析
利用TASSEL 5.0对406份小麦进行群体结构分析（图4）可知：群体结构主要和地理来源（麦区）分布有关，406份世界小麦可分为三个群体，其中亚群 Ⅰ主要包含222份来自于十大麦区的材料，亚群 Ⅱ 主要包含139份ICARGA品种和美原品种的材料，亚群 Ⅲ 有45份混合材料，群体结构与材料来源地密切相关。
3.5.3连锁不平衡分析
使用TASSEL V5.0进行连锁不平衡分析，当R2衰减到0.6时，LD衰减距离为1.92 Mb。因此本研究中，同一染色体上相邻显著关联位点之间的距离在1.92 Mb范围内的都属于同一个QTL区间。
3.6全基因组关联分析
本研究选用MLM（表型 基因型 群体结构 亲缘关系）模型，用筛选后的139601个标记与13个种子活力相关的表型指标，通过TASSEL 5.0进行全基因组关联分析，标记关联阈值P设定0.001，当P≤0.001时标记与性状关联显著，P≤0.0001时极显著关联。
3.6.1标准发芽试验的全基因组关联分析
三个环境下，共检测到相关的显著SNP位点2417个，极显著的SNP位点253个。极显著位点除2D染色体1个、7D染色体上2个外，其余染色体上检测到的极显著SNP位点多且成簇存在，解释了4.37%-6.71%的表型变异。有22个QTL区间内分布的极显著SNP至少被检测到3次以上。
共检测到与发芽率相关的显著SNP位点有341个，分布在1A、1B、1D、2A、2B、3A、3B、3D、4A、4B、5A、5B、6A、6B、7A、7B染色体上，解释了3.21%-5.62%的表型变异，除1D、 3D、4B染色体上检测到的显著位点分别只有1个外，其余染色体上显著的SNP位点多且成簇存在。共检测到与发芽势相关的显著SNP位点有569个， 1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4A、5A、5B、6A、6B、6D、7A、7B、7D染色体上均有分布，解释了3.22%-6.24%的表型变异。极显著的SNP位点66个，其中有4个QTL区间内分布的极显著SNP至少被检测到3次，说明这4个重要QTL区间可能存在发芽势有关的候选基因，其中有34个极显著SNP位点成簇分布在1B染色体的198.76Mb-268.60Mb区间内。共检测到与发芽指数显著相关的SNP位点376个，分布在1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、4A、4B、5A、5B、5D、6A、6B、7A、7B、7D染色体上，解释了3.22%-5.95%的表型变异，其中有4个极显著的SNP成簇分布在1B染色体上的235.38Mb-236.99Mb区间内。共检测到与发芽指数显著相关的SNP位点463个，分布在1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4A、4D、5A、5B、5D、6A、6B、7A、7B、7D染色体上，解释了3.17%-6.00%的表型变异。1A染色体上有3个极显著位点成簇分布在区间11.24Mb内，剩余3个位点成簇分布在区间18.29Mb-19.90Mb内。2B染色体上有5个极显著SNP位点分布在725.74Mb-725.96Mb区间内，15个极显著SNP位点分布在754.55Mb-754.93Mb内。
3.6.2人工加速老化试验的全基因组关联分析
对人工加速老化试验下的三个环境中各指标进行了分析，共检测到显著标记1650个，E1环境下547个显著标记，E2环境下检测到了572个显著标记，E3环境下检测到了531个显著标记，这些显著标记在1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4A、4B、4D、5A、5B、5D、6A、6B、6D、7A、7B、7D染色体上均有分布，解释了3.17%-6.18%的表型变异。
两个及以上的环境或性状中同时被关联的QTL区间有33个，分布在1A、1B、2A、2B、2D、3A、3B、4A、5A、5B、6A、6B、7A、7B染色体上，这些QTL区间认为是与种子活力相关的稳定QTL区间。其中1A、1B、2A、2B、3B、7A染色体上的稳定QTL区间在3个指标和3个环境中均被检测到，1B染色体上位于15-17Mb的QTL区间在E1、E2、E3三个环境中都能被检测到，2B染色体上位于749-750Mb、754-755Mb的QTL区间在活力指数、老化活力指数、电导率中均被检测到。
3.7 候选基因的预测
对与活力指数，老化活力指数、电导率相关的稳定候选区间在中国春1.0基因组中查询候选基因，在33个稳定区间内共查找到1321个基因。与VI、AVI、EC共同相关的103个基因，分布在2B染色体上的749-750Mb和754-755Mb处，主要是与酶相关的基因，其中包括还原酶，细胞色素P450，脂氧合酶，蛋白激酶，水解酶等。蛋白激酶是一类催化蛋白质磷酸化反应的酶，参与植物的抗逆性、生长发育和激素信号传递等一系列植物生命活动进程。细胞色素P450参与植物的生物合成和生物解毒途径，如激素合成、许多萜类化合物的生物合成，包括赤霉素、脱落酸等，赤霉素是重要的植物生长调节物质，与种子活力密切相关。植物种子的萌发，需要大量水解酶的参与，这些酶将种子贮藏蛋白水解为氨基酸小分子，为植物的生长发育提供氮源。脂氧合酶在植物的生长发育、成熟衰老以及抗逆过程中起着重要的调节作用。因此重复检测到的位点中筛选出的103个基因与种子活力密切相关，是重要的候选基因。
与活力指数、老化活力指数的候选基因中，有33个基因的功能注释与转录因子有关，这些转录因子主要是MYB转录因子、WRKY转录因子、GATA转录因子。例如位于2B染色体上与VI和AVI有关的基因TraesCS2B01G617700.1，3B染色体上与EC相关的基因TraesCS3B01G367500.1，5A染色体上与AVI相关的基因TraesCS5A01G041500.1。
另外有大量和蛋白相关的基因，其中与跨膜蛋白有关的基因有20个，跨膜蛋白与细胞物质的进出密切相关。比如位于1A染色体上与AVI和EC相关的基因TraesCS1A01G051900.1，1B染色体上与VI和EC相关的基因TraesCS1B01G453000.1。此外还有24个基因功能注释与F-box家族蛋白有关，该家族蛋白能响应多种非生物胁迫，它能在植物不同器官中调控多个靶位点来优化植物生长发育。有14个基因与含五肽重复序列的蛋白质相关，五肽重复超家族蛋白在调控植物生长发育方面发挥着重要作用。这些功能注释为跨膜蛋白的基因，是在VI、AVI、EC相关的区间中检测到的，与种子活力有关。
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