DOI：doi.org/10.1038/s42255-022-00591-z
测量细胞和体内活性氧和氧化损伤的指南
Guidelines for measuring reactive oxygen speciesand oxidative damage in cells and in vivo
摘要活性氧(ROS)的多重作用及其对健康和疾病的影响在整个生物科学中不断涌现。这导致不熟悉ROS及其反应复杂性的研究人员不恰当地使用商业试剂盒和探针来测量ROS和氧化损伤，将ROS视为一个离散的分子实体。不幸的是，这些测量的应用充满了挑战和限制。尽管关于如何最好地评估个体ROS、它们的反应、作为信号分子的作用以及它们可能引起的氧化损伤已经有了完善的知识体系，但这可能会导致文献中出现误导性的说法并阻碍研究进展。在这份共识声明中，我们阐明了许多常用的ROS和氧化损伤测量方法可能出现的问题，并提出了最佳实践指南。我们希望这些策略对那些发现自己的研究需要评估细胞和体内ROS、氧化损伤和氧化还原信号传导的人有用。
来自不同领域的研究人员经常需要测量ROS，评估氧化事件，并使用抗氧化剂或抑制剂来调节观察到的现象来研究其生物学重要性。有许多可用的检测方法和商业试剂盒，但它们的使用具有挑战性并且容易受到人工制品的影响。生物物理学/生物化学/化学领域有一个成熟的领域，重点关注活性氧的识别、它们的化学反应和氧化损伤的产物。当需要了解特定的分子机制时，由于依赖声称可以测量“ROS”或“氧化损伤”的商业试剂盒，或者由于使用“抗氧化剂”，经常会出现问题。
为了解决这些问题，我们制定了有关ROS、氧化反应和氧化损伤的命名和测量的指南。我们的重点是用于测量ROS和氧化损伤的技术。但同样要注意，ROS水平的变化以及随之而来的氧化还原敏感细胞过程活动的变化是氧化还原信号传导领域的核心。
活性氧(ROS)是源自O2且比O2本身更具活性的物质的总称。该术语不仅包括超氧自由基阴离子（O2−）和一些其他氧自由基，还包括O2的一些非自由基衍生物，如过氧化氢（H2O2）、次氯酸（HOCl）和过氧亚硝酸盐/过氧亚硝酸（ONOO−/ONOOH）。因此，所有氧自由基都是ROS，但并非所有ROS都是自由基物质（后者被定义为具有一个或多个不成对电子的物质）。“反应性”是一个相对术语；O2−和H2O2在与生物分子发生反应时具有选择性，对大多数生物分子无作用，而·OH会攻击一切（表1）。
当体内产生ROS时，许多抗氧化剂会发挥作用。它们的相对重要性取决于：（1）生成哪种ROS、生成量以及生成时间，（2）生成方式和地点，（3）测量ROS损害的目的。
抗氧化剂的一个定义是“任何能够延迟、防止或抑制活性的物质”。消除对目标分子的氧化损伤”。不存在通用的“最佳”抗氧化剂：不同的抗氧化剂以不同的速率与不同的ROS发生反应，作用于不同的位置并保护不同的分子靶标。另一种定义是“与氧化剂发生反应以调节其与其他靶标的反应，从而影响氧化还原依赖性生物信号传导途径和/或氧化损伤的物质”。
氧化损伤：ROS攻击生物体成分引起的生物分子损伤。氧化损伤水平的增加可能是由于ROS产生增加造成的，也可能是由于修复或清除过程减少造成的，例如，未能足够快地清除氧化蛋白质或修复氧化DNA：这两种情况都可能发生在某些疾病中。
生物标志物：可以定义为可以在体内或其产物中测量并影响或预测结果或疾病发生率的任何物质、结构或过程。
什么是活性氧、抗氧化剂和氧化损伤
表1 生物系统中常见的ROS
ROS化学式反应寿命
超氧自由基阴离子O2·−选择性反应，不攻击大多数生物分子可还原过渡金属（Fe3+、Cu2+），反应速率取决于金属离子配体与一氧化氮（k2> 109 M−1 s−1）快速反应，生成过氧亚硝酸盐：O2·−+NO·→ONOO−。并与其他自由基形成氢过氧化物：O2·−+R·+H+→ROOH。可以损害某些含有Fe-S簇的酶。
过氧化氢H2O2与大多数生物分子不发生反应与大多数硫醇反应缓慢，例如GSH的k≈ 1 M−1 s−1，但与某些蛋白质Cys残基反应更快，特别是那些具有低pKa的残基与某些过渡金属离子反应生成·OH(速率常数102–107 M−1 s−1，取决于金属和金属离子的配体）主要生物反应是与血红素、硫醇和过氧化物酶发生与CO2反应形成更具反应性的过一碳酸盐(HCO4−)。
羟基自由基·OH不加区别地做出反应；以接近扩散控制的速率与邻近的任何物质发生反应。
过氧亚硝酸盐（过氧亚硝酸盐的生理混合物，ONOO−及其更具反应性的质子化形式，过氧亚硝酸，ONOOH；pKa6.8）ONOO−/ONOOH与硫醇和过渡金属中心直接反应高达107 M−1 s−1；与CO2反应生成亚硝基过氧碳酸盐(ONOOCO2−)过氧亚硝酸盐本身可以氧化多种生物分子，或者过氧亚硝酸均分解可以生成·OH：ONOOH→NO2·+·OH，但更重要的反应是ONOOH→NO3−+H+ONOO−+ CO2→ONOOCO2−→次要(CO3·−+NO2·)+ 主要(CO2+NO3−)
碳酸根阴离子CO3·−由CO2与过氧亚硝酸盐反应形成（见上文），也由HCO3−与·OH反应形成。具有相当的反应性，氧化DNA中的鸟嘌呤、半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸
次卤酸（次氯酸、次溴酸）HOClHOBr强氧化剂，主要与硫醇和蛋氨酸反应与胺反应生成仲氯胺/溴胺，其保留较少（但仍然相当大）的氧化能力与许多体液中高含量的硫氰酸盐（SCN−）快速反应，生成HOSCN（也是由过氧化物酶产生）；HOSCN的反应性较低且对硫醇具有高度特异性。
单线态氧1O2O2存在两种单线态，尽管只有1Δg态（不是自由基）具有主要的生物学相关性。单线态电子构型使得该态比基态三线态O2·更具反应性。可以通过光敏反应形成，其中卟啉、核黄素、胆红素和叶绿素等分子吸收光并将该能量转移到基态O2，也可以通过过氧自由基和HOCl等的化学反应形成
二氧化氮自由基NO2·主要大气污染物。也由过氧亚硝酸盐（见上文）和过氧化物酶氧化亚硝酸盐(NO2−)产生。快速氧化富电子化合物（例如抗坏血酸盐和硫醇）。与酪氨酸、色氨酸、脂质和DNA碱基（例如鸟嘌呤）衍生的自由基发生加成反应，得到硝化产物（例如3-硝基酪氨酸、硝基色氨酸、硝基脂质和硝化DNA碱基）。一些硝化产品具有信号功能。
ROS是一个缩写，涵盖了具有不同性质、反应性和相互作用的多种化学物质（框1）。例如，生物学中发现的一种重要的活性物质，超氧自由基阴离子（O2·−），是由氧（O2）的单电子还原形成的。O2·−本身的反应性并不强，除非与另一种一氧化氮自由基(·NO)形成过氧亚硝酸盐，或与蛋白质中的Fe-S簇反应。同样，由各种氧化酶和超氧化物歧化酶(SOD)作用形成的过氧化氢(H2O2)的反应性较差，这使其可以用作体内重要的信号分子。然而，在亚铁或亚铜离子存在的情况下，H2O2通过芬顿化学形成极其活泼的羟基自由基(·OH)：·OH与任何附近的生物分子发生非特异性且基本上瞬时的反应（表1）。过渡金属离子催化芬顿反应的可用性在体内受到严格控制，但这些离子可能会因组织损伤或某些具有Fe-S簇的蛋白质遇到O2·−时而释放。最近越来越多的关于铁死亡的文献强调了它们在体内的重要性，铁死亡是一种涉及“催化”铁离子的细胞死亡形式。H2O2是血红素过氧化物酶（例如髓过氧化物酶）的底物，可产生下游活性物质，例如HOCl（表1）。尽管其整体反应性较差，但H2O2可以选择性氧化某些蛋白质中的一些蛋氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)残基。
表1列出了生物学中最常见的ROS的物理化学特性，该列表提供了有关当这些物质产生时体内可能发生哪些反应的见解。“反应性”是高度依赖环境的，因为不同ROS的反应性在很大范围内变化，它们的寿命、扩散能力和产生下游反应性物质的潜力也是如此。简而言之，并非所有ROS都是相同的。广义的“ROS”虽然被广泛使用，但并没有提供有关导致观察到的效果的实际化学物质的信息。ROS测量建议摘要一般建议
1如果可能，请避免使用术语“ROS”并定义所涉及的实际化学物质及其特性。如果没有，请讨论有关ROS术语的注意事项。
2抗氧化剂的任何推定作用都应该在化学上是合理的，并通过氧化损伤的测量来证实。
3选择性产生O2·–和H2O2，以及氧化还原酶的特异性抑制/删除，应用于确认这些物种的作用。
4在呈现氧化损伤标志物水平时，应讨论生物分子的氧化损伤如何产生、修复、清除以及测量。
活性氧测量
5仅当所测量的物种和检测方法得到解释且化学上合理时，才可使用商业试剂盒。
6使用荧光ROS探针时，应明确选择性和潜在的假象（尤其是DCFH-DA）。应进行控制以表明响应是由所提议的物种引起的，并使用正交技术来证实结论。
7ROS不应在组织匀浆或冷冻切片中“测量”。
8要在体外检测O2·–，请使用细胞色素c的SOD敏感还原，而在体内可使用线粒体内的乌头酸酶失活。使用鲁米诺或光泽精时要小心。
9氢乙啶或MitoSOX探针不能用于通过简单的荧光测量来检测O2·–的产生。使用2-羟基乙锭产品的特异性鉴定代替。
10基因编码荧光探针是体内H2O2的灵敏检测器。
氧化损伤的测量
11不建议将TBARS测定应用于细胞、组织或体液作为脂质过氧化的唯一测量方法。
12使用适当的内标通过LC-MS/MS测量F2-IsoP是脂质过氧化的首选生物标志物。
13通过ELISA、FTC和免疫印迹分析蛋白质羰基可以检测一般氧化蛋白质损伤。鼓励采用正交方法来量化各个氧化产物。
14可以使用彗星测定法对分离的细胞进行核酸氧化修饰的测量，并通过UPLC-MS/MS测定体液或组织中的8OHdG和8OHG。
15使用抗体测量特异性氧化产物必须纳入对非特异性相互作用的控制以及与真实表位的竞争数据。
16必须测量生物标志物，以确认所使用的任何抗氧化剂都能减少对相关生物分子的氧化损伤。
建议1：只要有可能，应说明生物过程中涉及的实际化学物质，并考虑观察到的效果是否与其反应性、寿命、产生的产物和体内归宿相一致。如果这是不可能的，则应讨论有关使用术语“ROS”的警告。生物学中存在多种抗氧化剂，其中包括与单种ROS发生反应以减少氧化损伤和/或调节氧化还原信号传导的酶和小分子。与“ROS”一样，使用“抗氧化剂”作为通用术语可能不精确且具有误导性。通常，假定的抗氧化剂对生物学结果的影响被用来推断ROS的作用，就好像所有抗氧化剂都是等效的一样。然而，每种抗氧化剂都有其特定的化学性质以及与不同活性氧的反应性。此外，体内主要的抗氧化剂是酶系统，例如用于O2·−的SOD、用于H2O2的过氧化物酶以及金属离子螯合。大多数常用作“抗氧化剂”的低分子量化合物是某些ROS的化学计量清除剂，通常与O2·−或H2O2具有适度的反应性。例如，N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种广泛使用的“抗氧化剂”，但它还有其他作用模式。NAC确实可以在体外清除一些ROS，但不能清除其他ROS，尤其是不能清除H2O2。它还可以增加细胞Cys库，从而提高谷胱甘肽(GSH)水平，产生H2S，并直接裂解蛋白质二硫化物。在体内起到抗氧化剂作用的低分子量化合物包括维生素E，它可以清除脂质过氧自由基。有时，“·OH清除剂”被用来推断该ROS的作用，但它们很少达到足够高的浓度以防止·OH与生物分子发生有效的瞬时反应。因此，“抗氧化剂”（尤其是NAC）的许多生物效应是由其他效应引起的。其他经常用作“抗氧化剂”的药物，例如TEMPO/TEMPOL、mito-TEMPO和基于卟啉的“SOD模拟物”，在体内经历复杂的氧化还原反应，最好将其描述为“氧化还原调节剂”，而不是“抗氧化剂”或“O2·−清除剂”'。建议2：对于归因于抗氧化活性的干预措施，需要明确“抗氧化剂”针对的特定化学物质。应该认识到，低分子量“抗氧化剂”不太可能通过清除H2O2发挥作用。细胞内抗氧化剂的特异性、速率常数、位置和浓度应使得抗氧化作用在化学上合理。应尽可能通过测量氧化损伤的减少来确认抗氧化剂的活性。将氧化损伤或氧化还原信号通路激活归因于特定ROS的关键过程是在生物环境中选择性生成ROS。这可以通过使用氧化还原循环化合物（如百草枯(PQ)或醌）来生成O2·−，或使用MitoPQ在线粒体内生成O2·−来实现。当然，增加O2·−产生也会增加O2·−歧化产生的H2O2。葡萄糖氧化酶可用于在体外直接生成H2O2，而细胞内H2O2的调节生成可通过基因表达的d-氨基酸氧化酶来实现，该酶在氧化d-氨基酸时会生成H2O2。它可以靶向细胞中的不同位点，并通过改变其底物d-丙氨酸的添加浓度来调节流量。NADPH氧化酶(NOX)是氧化还原信号传导和氧化损伤中O2和H2O2的重要来源，调节其活性是了解这些过程的重要方法。已经描述了许多相当特异的NOX酶抑制剂。然而，apocynin和二苯基氯化碘盐等化合物作为“NOX抑制剂”的使用仍然广泛，尽管它们缺乏特异性。建议3：我们建议使用PQ、醌和MitoPQ选择性生成O2·−并使用d-氨基酸氧化酶的细胞表达来控制H2O2生成。避免使用apocynin和二苯基氯化碘盐对某种现象的抑制作用作为NOX酶作用的唯一证据，或者至少讨论它们缺乏特异性。应使用特定的抑制剂或NOX成分的缺失或敲低来确定其作用。ROS和氧化损伤测量的一般原则在研究生物系统中的ROS时，检测和量化特定ROS非常重要。这可以使用电子顺磁（自旋）共振(EPR/ESR)、各种探针分子或通过测量ROS引起的氧化修饰来完成。大多数ROS探针仅捕获形成的ROS的一小部分。事实上，如果探针与产生的大部分ROS发生反应，这会扰乱系统并影响实验结果（例如，抑制氧化损伤或干扰氧化还原信号传导）。然而，重要的是捕获百分比在不同的ROS生产速率下保持大致恒定。氧化损伤有多种形式：特定ROS产生的化学过程以及如何对其进行评估和量化都很复杂。此外，测量的任何氧化损伤生物标志物的最终水平是其产生速率与其通过修复、降解、排泄或扩散去除的速率之间的差异。建议4：当显示任何生物分子的氧化损伤水平时，应明确其产生的化学过程以及用于量化它们的方法。应考虑和讨论修复和清除对最终测量水平的影响。ROS检测和测量的指南和限制将活性氧、抗氧化剂和氧化损伤视为整体概念限制了实验的精度，并阻碍了建立精确分子机制的需要。要将这些规则付诸实践，需要测量特定的ROS和/或氧化损伤产物，以及抗氧化剂的作用。这是一个重大的挑战，因为大多数ROS寿命都很短（寿命为毫秒或更短），并且它们的稳态水平很低（皮摩尔到低微摩尔）并且变化很快，因为它们受到不断变化的生成速率、化学反应和扩散的影响。表2 不同生物背景下ROS检测和定量的一些推荐方法氧化剂原理方法背景检测(D)/定量(Q)区分不同ROS所需的控制
超氧自由基阴离子（O2·−）乌头酸酶释放铁乌头酸酶活性测定TT, C, OD, Q受SOD抑制
细胞色素c还原光谱学TT, CD, Q受SOD抑制，不含半醌/醌
二氢乙啶氧化成2-羟基乙锭LC分离，荧光或MS检测TT, C, OD, Q需要验证产品为2-羟基乙锭；受SOD抑制
自旋捕获ESR/EPRTT, BF, C, A, HD, Q灵敏度低；信号被SOD抑制；需要仔细控制
过氧化氢(H2O2)由过氧化氢酶形成化合物600nm处的光学差异光谱TT, C, O, BFD, Q用氢供体（例如甲醇）滴定并允许通量测量
硼酸盐探针的氧化（例如PO1、MitoB、MitoPY1、硼酸笼状荧光素）荧光/发光检测或MS(mitoB)TT, C, BF, O, AD, Q受到去除H2O2的酶的抑制；需要考虑其他ROS的贡献：特别需要排除ONOO−的参与（例如，使用NOS抑制剂）
基因编码的硫醇探针（例如HyPer7、roGFP2-Orp1、roGFP2-Tsa2）荧光检测TT, C, O, AD, Q并行使用突变（即氧化不敏感）探针来识别假象
Amplex Red的过氧化物酶催化氧化光学光谱仪BF, C（仅释放H2O2）D, Q不适用于细胞内测量或复杂系统；被H2O2去除酶抑制；还原剂和过氧化物酶底物干扰
过氧亚硝酸盐/过氧亚硝酸(ONOO−/ONOOH)二氧化氮自由基(NO2·)来自内源靶标的硝化产物（例如，来自Tyr的3-硝基酪氨酸、来自色氨酸的6-硝基色氨酸、来自鸟苷的8-硝基鸟苷、硝化脂质）或添加的外源探针（例如，硼酸盐）LC–MSTT, C, BF, O, A, HD, Q需要真实的标准；最好通过重同位素标准进行定量；NO2·也由NO−的过氧化物酶活性形成
抗体（例如，在ELISA、免疫印迹、免疫细胞化学中）TT, C, BF, O, A, HD需要经过充分表征和验证的抗体
碳酸根阴离子(CO3·−)直接测量EPR/ESR光谱TT, BFD, Q灵敏度低
次氯酸(HOCl)来自内源性靶标的氯化产物（例如，来自Tyr的3-氯酪氨酸、氯化脂质）或添加的探针（例如，来自二氢乙锭或次氯酸盐的氯化乙锭）LC–MSTT, C, BF, O, A, HD, Q需要仔细控制；最好通过重同位素标准进行定量
单线态氧(1O2)直接探针氧化（例如，单线态氧传感器绿色）或将氧化学添加到探针分子（例如，蒽）通过近红外荧光分光光度法检测到-1,270 nm处的微弱磷光TT, BF, CD, Q使用D2O缓冲区增强信号；清除剂/猝灭剂，例如叠氮化物和组氨酸，也与自由基发生反应
荧光或LC-MSTT, BF, OD, Q
在简单的体外系统中，可以检测多种ROS（表2）。例如，可以通过细胞色素c的减少来监测O2·−的产生，并通过添加SOD的抑制来评估其选择性。然而，即使是这样一个“简单”的系统也可能非常复杂。例如，半醌可以在SOD抑制的反应中减少细胞色素c。最重要的是，用于评估ROS的所有方法都容易受到人为因素的影响，并且需要适当的控制来确定测量的物种和数量。因此，使用“正交技术”来证实测量结果非常重要，“正交技术”依赖于使用不同检测方法的替代方法，以避免特定方法的局限。当人们试图测量细胞中的ROS时，这些复杂性就会被放大。由于培养基中有限的抗氧化剂和相对于体内的氧气浓度较高，常用的细胞培养条件会促进氧化损伤。因此，培养细胞比体内细胞产生更多的ROS。建议5：只有当试剂盒材料中解释了所测量的实际物种和检测方法、化学上合理且了解其局限性时，才使用商业试剂盒。不要使用没有此类信息的商业成品。为了避免方法特定的局限性，请使用依赖于不同检测原理的技术来确认结果。小分子荧光探针经常用于评估细胞内的ROS。在某些情况下，通常涉及试剂盒，缺乏对这些探针的化学反应性或结构的描述使得难以解释结果，因此应避免使用此类探针。即使对于已知结构的探针也可能存在问题。考虑广泛使用的荧光探针2',7'-二氯二氢荧光素(DCFH)，通常以其二乙酸酯(DCFH-DA)形式施用，很容易进入细胞。DCFH被多种ROS氧化成荧光产物2',7'-二氯荧光素(DCF)，因此它对任何特定的ROS不具有特异性。DCFH不会直接被H2O2氧化（通常声称可以检测到），而是只有在H2O2被氧化还原活性金属或血红素蛋白（如细胞色素c或过氧化物酶）转化为更具反应活性的物质后才被氧化。此外，DCFH的氧化和DCF的荧光对局部O2水平和pH值敏感，并且荧光产量可能与ROS水平增加不成线性关系。这并不是说DCFH和其他非特异性荧光探针（例如二氢罗丹明）不应使用，但应理解它们的局限性（选择性、定量问题、线性和对人为因素的敏感性）并谨慎看待结果。特别是，如果没有详细的实验控制来验证这一点，它们的反应不应归因于特定的ROS，并且它们的使用应仅限于对细胞氧化还原状态变化的初步评估，然后对机制进行更详细的研究。虽然许多小分子和蛋白质荧光探针比DCF更具选择性，但通过许多简单的对照来验证数据始终很重要：响应是否随时间和生物样品量以合理的方式变化？是否可以通过生成感兴趣的ROS来复制该效果（例如使用PQ生成O2·−或使用d-氨基酸氧化酶生成H2O2）？应该中断ROS生成过程的阴性对照（例如基因敲除、基因敲减、抑制剂、自由基清除剂）是否会按预期做出反应？建议6：当使用荧光ROS探针（特别是DCFH-DA）时，应明确并讨论所涉及的化学成分、特定化学物质的选择性和潜在的假象。只要有可能，应进行控制以表明响应是由所提议的物种引起的，并使用正交技术来证实结论。将ROS测量范围从培养细胞扩展到体内或离体组织至关重要。然而，在某些情况下，这一差距已通过在新鲜或先前冷冻的组织切片或离体匀浆中添加“ROS探针”来解决。这些测量可能毫无意义，因为活性氧的寿命非常短，这意味着在对材料进行分析时，体内存在的任何活性物质都早已消失。此外，冷冻或均质化会破坏膜并改变底物和离子浓度（例如，提高Ca2+或“催化”Fe2+的水平），因此组织切片或匀浆中产生的任何ROS与体内产生的水平无关。当然，也有有效的方法可用于评估体内或灌注器官中的ROS，但在这些情况下，要么在体内监测该过程（例如使用过氧化氢酶化合物I来测量H2O2），要么将系统淬灭以稳定用于离体分析的探针。建议7：ROS的测量应在体内或离体生理相关条件下的细胞、组织或器官中进行。ROS不应在组织匀浆或冷冻切片中“测量”，除非当细胞/组织/器官处于生物学相关条件下时，所使用的探针或传感器能够不可逆地捕获活性物质。直接测量ROS.在这里，我们概述了目前测量常见ROS的最佳方法。超氧化物。在简单的系统中，O2·−可以通过多种方式测量，例如通过细胞色素c的SOD抑制还原。O2·−的生成也可以通过自旋捕获和EPR进行评估，其优点是可以直接检测自由基。乌头酸酶中的Fe-S簇会被O2·−和其他ROS灭活，但它与O2·−的相互作用快速、相当特异性且可逆，使其成为线粒体中O2·−的良好指示剂。化学发光“超氧化物探针”鲁米诺和光泽精被广泛用于“检测O2·−”，但解释此类数据很困难，因为这些探针会产生自由基，而自由基本身会产生O2·−；它们不直接与O2·−反应。建议8：不鼓励使用鲁米诺和光泽精来“检测O2·−”，但它们可以用作ROS产生增加的一般指标。体外SOD敏感的细胞色素c还原和线粒体内乌头酸酶失活是更好的策略。在细胞中，通常通过测量二氢乙锭（有时称为氢乙锭(HE)）或线粒体靶向HE(MitoSOX)氧化产生的荧光来检测O2·−。不幸的是，荧光检测具有误导性，因为这些探针同时形成乙锭（E+)，一种非特异性氧化产物，以及O2·−特异性产物2-羟基乙锭。由于这两种产品具有重叠的荧光光谱，因此很难区分非特异性氧化和O2依赖性氧化对整体荧光的贡献。使用液相色谱-质谱可以对2-羟基乙锭产物进行准确定量。另一个应考虑的因素是HE/MitoSOX的细胞摄取程度以及这些物质及其多种产物的细胞内浓度。此外，HE氧化产物插入DNA中，大大增强了它们的荧光并创造了另一种人工产物。NeoD和MitoNeoD含有修饰的HE，不会插入DNA。线粒体积累的O2·−探针，例如MitoSOX，通常用于“检测线粒体内的O2·−”。当使用这些探针以及其他带有正电荷或产生带正电荷的物质（包括2-羟基乙锭和乙锭）时，重要的是要记住探针的积累取决于血浆和线粒体膜电位以及线粒体的大小、形状和质量。此外，当这些物质在线粒体中以高浓度存在时，荧光可能会被猝灭。建议9：当产品已被独立验证为2-羟基乙锭时，仅使用HE或MitoSOX探针通过简单的荧光测量来检测O2·−。使用二氢乙锭和MitoSOX等探针进行荧光测量时，应使用尽可能低的探针浓度进行，并且必须包括对血浆和线粒体膜电位以及线粒体质量和形态变化的控制，例如标准化为类似的膜电位响应但氧化还原不敏感的探针。如有可能，应采用LC-MS方法来测量所有修饰物质。过氧化氢。在简单的系统中，H2O2可以通过辣根过氧化物酶(HRP)氧化底物来测量，其中一种常用的底物是AmplexRed。这些方法可能会受到其他HRP底物（例如抗坏血酸和NAC）和O2·−（可使HRP失活）的干扰，后者可通过添加SOD来预防。由于H2O2可以直接或通过水通道蛋白跨膜，因此该系统也可用于测量细胞中H2O2的释放。然而，请注意，这种释放反映了H2O2的产生、细胞内酶的去除以及细胞外扩散速率之间的平衡。在细胞内，基于苯基硼酸盐的探针检测H2O2更为可靠，尽管这些探针可能缺乏足够的灵敏度，因为它们与H2O2反应缓慢，这使得难以检测H2O2水平的微小或局部变化。然而，最近的研究表明，硼酸与H2O2反应更快，可能是更灵敏的检测器。苯基硼酸盐氧化成酚的机制需要双电子氧化剂，例如H2O2。由于H2O2产生的浓度通常高于其他ROS，因此硼酸盐探针在适当的控制下可以选择性地检测H2O2。然而，硼酸盐探针与ONOO−/ONOOH或HOCl的反应比与H2O2的反应快得多，这有时会使测量复杂化，正交方法或使用抑制剂可以帮助验证。例如，可以使用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂和过氧化氢酶来区分H2O2和过氧亚硝酸盐依赖性信号。基因编码的荧光蛋白传感器在细胞H2O2检测方面取得了重大进展。这些探针含有二硫醇开关，可根据其氧化状态改变探针的整体荧光。通过将氧化还原敏感的绿色荧光蛋白(GFP)突变体与H2O2敏感的硫醇蛋白（如oxyR（HyPer系列））或过氧化物酶（如Orp1或TSA2(基于roGFP2的探针）。HyPer7和roGFP2与过氧化还原蛋白耦联可提供最高的灵敏度。虽然基于HyPer7和roGFP2的探针具有pH稳定性，但早期版本的HyPer则不然，并且需要表达对照探针(SypHer)来控制由于pH变化而导致的信号变化。通常采用荧光显微镜进行成像分析，但也可以使用荧光板读数器。测量的氧化还原状态代表细胞还原剂（包括谷氧还蛋白/谷胱甘肽和硫氧还蛋白）氧化和再还原探针的速率之间的平衡，从而可以对氧化还原状态进行实时、活细胞评估。由于使用了还原探针和氧化探针的激发波长，因此探针是比例式的，并且输出不依赖于蛋白质探针表达的水平。通过纳入适当的靶向基因序列，这些探针可以定向到不同的细胞区室，包括线粒体、微管、内质网、细胞核和细胞质。因此，可以研究感兴趣的亚细胞区域，然后通过完全还原（2mM二硫苏糖醇）、冲洗和完全氧化（2mM叔丁基氢过氧化物）最后校准探针。这种校准产生了氧化百分比的测量，允许在实验之间和亚细胞区室之间进行比较。这些探针已在转基因动物中表达，以提供体内H2O2生成的有用评估。病毒载体的质粒转染可用于培养细胞，并且靶向roGFP2探针可在商业上购买（www.addgene.com）。在大多数实验中，H2O2探针表达为分布在细胞内的游离蛋白质。然而，鉴于细胞内H2O2扩散距离的不确定性，仍不清楚需要什么分辨率才能了解亚细胞H2O2分布。因此，将H2O2探针束缚在亚区室位置，如蛋白质复合物或细胞器接触位点是一种重要的方法。建议10：基因编码的荧光探针是目前最灵敏的H2O2检测器，如果可以表达，我们建议在细胞和动物中使用它们。硼酸盐探针是首选的小分子探针，但需要确定H2O2特异性的对照，并且生理H2O2水平的灵敏度有限。如果不存在其他还原剂或过氧化物酶底物，AmplexRed与HRP可以测量细胞释放的H2O2。过氧亚硝酸盐。过氧亚硝酸盐(ONOO−)具有复杂的化学性质，其本身可以氧化某些生物分子。主要的生理反应是与CO2发生的（表1），因此生物系统的CO2/HCO3−含量在确定ONOO−的生物影响中发挥着重要作用。该反应的产物包括活性物质，例如碳酸根阴离子(CO3·−)和硝化剂二氧化氮(NO2·)（表1），两者都与许多通用的“ROS探针”发生反应。过氧亚硝酸盐氧化硼酸盐探针的速度比H2O2快近一百万倍，在适当的条件下，这些探针可用于评估ONOO−/ONOOH的产生。硼酸盐探针已被用于在离体组织中测量过氧亚硝酸盐。次氯酸和其他活性卤素物质。HOCl、次溴酸(HOBr)以及由它们衍生的一些氯胺和溴胺（表1）与大多数用于检测ROS的通用探针发生反应，包括DCFH和鲁米诺。然而，许多这些探针也是产生HOCl或HOBr的过氧化物酶的底物，这影响了它们的使用。目前已有一种针对活性卤素物质的更特异的荧光探针，也开发出一种针对活性卤素物质的基因编码探针，能够在细胞培养物和体内动态监测这些物质。氧化损伤的测量ROS的存在可以通过其对蛋白质、碳水化合物、核酸和脂质产生特定化合物的作用来推断，只要这些化合物不能通过其他机制形成，就可以用作氧化损伤的“生物标志物”（框1）。然而，请注意，测量的生物标志物水平代表了生物标志物的产生和去除（例如，通过降解、扩散或排泄）之间的平衡，加上由以下因素引起的任何人为增加的水平：分离或分析过程中的氧化损伤。脂质过氧化。多不饱和脂肪酸（PUFA）很容易被氧化，因此脂质过氧化产物被广泛用于表征氧化损伤。脂质过氧化可以由某些ROS引发，并作为随机、非酶促（通常是链式）自由基过程进行。然而，也有一些酶机制（例如脂氧合酶）可用于游离PUFA或PUFA磷脂的过氧化，产生具有生物学作用的特定信号产物。因此，在测量脂质过氧化时，重点可能放在建立增加的脂质过氧化作为氧化损伤的一个例子，或识别通过与某些细胞靶标选择性相互作用作为信号的单个氧化修饰脂质分子。在PUFA中，与亚甲基相邻的双键的存在使得亚甲基C-H键更弱，因此双烯丙基氢更容易被H·夺取。H·抽提产生的以碳为中心的自由基(L)通过双键上的离域而稳定。随后与O2反应产生过氧自由基(LOO)，并形成共轭二烯体系和一系列过氧化物(LOOH)。LOO·可以进一步反应产生高度氧化的次级产物，包括环氧、含氧或环状过氧化物。因此，脂质过氧化有多种最终产物，它们表现出巨大的化学异质性和可变的稳定性和极性，因此仅测量单个氧化产物不能代表脂质过氧化的整个过程。有几种方法可用于评估“一般”脂质过氧化。在简单的模型系统（例如分离的脂蛋白）中，二烯缀合可以通过紫外线(UV)吸光度来测量，但该方法不适合在细胞或体液中使用，因为存在干扰紫外线吸收分子，不会产生任何结果。来自脂质过氧化。在细胞中，“脂质过氧化”可以通过与过氧化敏感十一烷酸部分缀合的BODIPY的荧光变化来评估。该测定技术简单，但应谨慎，因为BODIPY与过氧自由基的反应速率比自由基清除抗氧化剂慢，因此抗氧化剂对BODIPY荧光的抑制不一定反映其抑制脂质过氧化的能力。另一种脂质过氧化荧光测定采用顺式石蜡油酸(PnA)，这是一种具有四个共轭双键的脂肪酸。PnA的氧化会破坏其共轭系统，从而破坏荧光。由于PnA可能掺入不同类别的磷脂中，因此高效液相色谱(HPLC)分离可提供有关不同磷脂氧化的信息。然而，由于PnA的氧化速率较高、容易发生光漂白以及PnA与不同磷脂的代谢掺入情况不同，因此很难将基于PnA的结果外推至内源性磷脂氧化。脂质过氧化通常通过测量最终产物（例如α,β-不饱和羟基烯醛）来评估，最好是通过基于MS的技术。特别是，4-羟基壬烯醛（HNE）的形成已被广泛使用。针对HNE形成的蛋白质加合物的抗体广泛存在，并经常用于组织的免疫染色，但应该意识到，不同的抗体可以检测不同的表位，从而给出不同的答案，具体取决于HNE与蛋白质中的氨基酸残基结合。脂质过氧化的一种次要最终产物是丙二醛(MDA)，如果通过MS技术测量，它也可以是一种有用的生物标志物。然而，广泛使用的利用硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)的“MDA测定”并不具有特异性，因为TBA会从MDA1以外的许多生物分子中产生色原。使用HPLC将“真正的”TBA-MDA加合物与假色原分离可提高特异性，但并不能消除所有问题。建议11：不建议将简单TBA测试(TBARS)或基于其用途的试剂盒应用于细胞、组织或体液，作为评估氧化脂质损伤的唯一测试，因为特异性低，可能导致假阳性结果。基于HPLC的TBA测试不易出现假象。用于详细分析氧化脂质混合物的LC-MS的发展彻底改变了脂质氧化产物的检测。收集和储存样品以避免人为过氧化是任何脂质过氧化研究的关键，用于后续分析的样品应立即冷冻在液氮中。生物流体可能需要添加化学物质（例如丁基羟基甲苯）以防止在储存过程中自动氧化。用于定量的内标应在溶剂萃取之前添加到样品中。这种基于LC-MS的方法具有灵敏度高、样品量要求小以及能够检测多种脂质过氧化终产物的优点。这使得LC-MS方案成为评估一般脂质过氧化和鉴定单个产品（包括具有特定信号功能的产品）的首选方法。然而，可用标准的限制有时可能会妨碍某些产品的定量分析。通过基于MS的方法量化的脂质氧化产物中最突出的是F2-异前列烷(F2-IsoPs)。花生四烯酸的自由基诱导的非酶促氧化可产生64种F2-IsoP立体异构体酸，并且可以与由环加氧酶（COX-1/2）对花生四烯酸进行酶促氧化而产生的产物分开。F3-和F4-异前列烷分别由二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)产生，但其表征不如F2-异前列烷好。ELISA方法已开发用于定量一种F2-IsoP异构体8-iso-PGF2α（也称为15-F2t-IsoP或iPF2α-III）。在所有这些研究中，市售ELISA试剂盒和MS方法之间的一致性较差；8-iso-PGF2α是花生四烯酸过氧化过程中产生的64种不同F2-IsoP异构体之一，8-iso-PGF2α与相关异构体之间的抗体交叉反应性具有挑战性。分析前样品净化可以通过ELISA更精确地测量8-iso-PGF2α，但迄今为止最准确的F2-IsoP定量方法是LC-MS/MS，强烈推荐使用该方法。建议12：F2-IsoP是普遍接受的脂质过氧化生物标志物，但应该认识到它们是许多最终产物之一，并且各种类型的水平可能受到实验条件的影响。使用ELISA进行定量容易受到人为因素的影响，但样品净化可能允许通过ELISA测量8-iso-PGF2α。具有适当内标的LC-MS/MS是首选方法。蛋白质损伤。蛋白质中的氨基酸残基对氧化修饰敏感，其中某些形式能提供可用的生物标志物。一种常见的蛋白质修饰是由于特定氨基酸残基氧化成带有羰基的产物而形成“蛋白质羰基”；醛与蛋白质上的亲核位点反应或通过糖化也可以形成羰基。许多测定涉及用2,4-二硝基苯肼衍生化羰基以形成二硝基苯腙(DNP)。该产品可以通过分光光度法进行检测，但这种方法可能存在背景值高和低重现性的问题；为了避免这种情况，可以在测量前通过LC分离DNP加合物。或者，可以通过ELISA或免疫印迹法使用针对DNP产品的抗体来检测羰基。可以在用荧光素5-氨基硫脲(FTC)处理的组织匀浆中测量蛋白质羰基的变化，以生成可通过凝胶电泳分离的荧光团标记的蛋白质。已经开发出使用生物素标记衍生化与LC-MS检测相结合的富集方法。蛋白质羰基、α-氨基己二酸半醛和谷氨酸半醛也通过稳定同位素稀释分析LC-MS/MS进行了单独测定。当然，单个时间点的数据反映了这些产物的形成和去除（例如通过修复或蛋白水解）速率之间的差异。使用MS进行蛋白质分析可以检测和鉴定具有特征质量增加的修饰（例如羟基化、硝化和氯化）。蛋白水解切割后的肽水平图谱可以检测修饰的性质、其在蛋白质序列中的位置以及母肽的伴随损失，从而实现相对定量。完全消化后的氨基酸分析可以确定特定物种（通过使用同位素标记标准品确定）以及亲本物种的类型和绝对浓度，从而确定“质量平衡”。在样品处理过程中必须小心，以防止半胱氨酸或蛋氨酸的人为氧化，并且在蛋白质水解过程中也必须小心，因为氧化蛋白质损伤的一些产物是不稳定的。LC-MS分析具有许多优点，包括高特异性、高灵敏度、同时检测多种不同修饰和母体物种的能力，以及检测诊断所涉及ROS的产物的能力，例如HOCl的氯化和硝化物种由髓过氧化物酶在NO2存在下的作用和/或ONOO-/ONOOH)的反应产生。这些LC-MS方法可用于从分离蛋白质到组织样品的各种材料。建议相对于未修饰的氨基酸或肽进行定量，最好是针对添加的重同位素标记材料进行定量，以克服样品处理和制备中产生的潜在人为因素。然而，血浆和尿液中氧化氨基酸的水平可能来自食物中蛋白质中氧化氨基酸的吸收，或病理导致的组织蛋白水解增加。这些都还没有被详细研究过。半胱氨酸是修饰的主要目标，因为它易于氧化（特别是硫醇盐形式RS−），并且具有亲核性，可与亲电子试剂形成加合物。氧化可能是不可逆的，例如氧化为亚磺酸或磺酸，这可能是氧化蛋白损伤的有用生物标志物。蛋白质中半胱氨酸残基的可逆氧化是氧化还原信号传导的一个重要机制。可逆产物包括二硫化物、磺酸、S-亚硝基硫醇和过硫化物。这些修饰可以通过GSH/谷氧还蛋白或硫氧还蛋白系统逆转。检测可逆修饰的Cys残基池的常用方法是首先用反应试剂封闭还原的硫醇，然后用可通过胰蛋白酶消化物的LC-MS识别的标签还原和衍生化先前氧化的残基。这些方法可以扩展到使用特定修饰化学来标记特定的氧化产物，例如S-亚硝基硫醇、次磺酸或过硫化物。直到最近，这些方法的主要局限性是总Cys库的覆盖率较低，并且缺乏对单个残基修饰的定量。在解释可逆修饰的生物学重要性时，后者尤其重要。同量异位标记在定量方面取得了显着的进步，其中首先用一个标签标记还原的半胱氨酸残基，还原可逆修饰的残基，然后用化学上相同但经过重同位素修饰的标签标记，从而能够对比例进行定量每个特定的半胱氨酸都被氧化。这些方法已扩展到包含生物素等部分的标签，这使得标记的肽得以富集，从而大大提高了半胱氨酸覆盖率。这种方法的最新迭代（如OxiMOUSe研究所示）已经取代了以前的方法。蛋氨酸也是氧化还原翻译后修饰的主要位点。甲硫氨酸亚砜还原酶可通过酶促逆转甲硫氨酸亚砜的氧化，从而可能通过单个氧原子的安装/去除来促进氧化还原信号传导。已经开发出用于蛋氨酸生物共轭的试剂，可以识别和表征蛋白质组中氧化还原敏感的蛋氨酸位点。建议13：ELISA、FTC和免疫印迹是检测蛋白质羰基作为一般氧化蛋白质损伤生物标志物的有用工具，但必须认识到并非所有蛋白质氧化产物都含有羰基。LC-MS方法使用精心制备的样品，由于其灵敏度、选择性和定量性，是评估蛋白质氧化的最佳可用技术。还鼓励使用正交方法，例如针对单个氧化产物的特异性和经过验证的抗体。核酸。DNA和RNA的氧化修饰通常用作氧化损伤的生物标志物。用于评估细胞中DNA的一般氧化损伤的一种方法是单细胞凝胶电泳，它可以检测DNA链断裂。这种断裂可以通过多种机制产生，不一定是通过氧化损伤，而是使用修复酶在氧化位点对DNA进行标记，从而增加了氧化DNA损伤的特异性。最简单的测量是对显微镜载玻片上凝胶上嵌入的细胞进行电泳后DNA重影的长度。DNA的氧化损伤通常集中在鸟嘌呤氧化为8-oxo-7,8-diHydro-2'-deoxyguanosine（8OHdG或8-oxodG）。尽管其他碱基的修饰可能具有重要的生物学意义，但有关其他碱基修饰的数据有限。这些测量需要分离DNA并消化它以释放修饰的碱基，并且在样品处理和分析过程中可能会出现虚假氧化。多实验室倡议已经制定了避免这种情况的方案，并确定了8OHdG的“正常”水平。DNA中测量的8OHdG（或任何其他DNA氧化损伤产物）的量是氧化速率与修复速率之间的平衡。最好的方法是超高性能LC-MS/MS(UPLC-MS/MS)。使用ELISA方法时应谨慎，该方法缺乏敏感性和特异性，批次之间的结果可能存在差异，而且8-羟基鸟苷(8OHG)和8OHdG之间有时会发生交叉反应。然而，如果应用得当，免疫组织化学可用于鉴定体内具有较高含量8-OHdG的细胞。DNA和RNA的氧化核苷可在各种体液中检测到。最初它们被认为是由DNA修复，特别是核苷酸切除修复引起的。然而，它们也源自通过去除氧化产物而“净化”的DNA和RNA核苷酸前体库的氧化。DNA修复和核苷酸库消毒对体液中检测到的氧化核苷水平的相对贡献目前尚不清楚。24小时内收集的尿液将代表DNA/RNA和/或在此期间氧化的相应核苷酸前体池中的鸟嘌呤数量。尿液采样代表了整个身体内的形成，最适合假设所有组织都受到影响的情况，但它可能不足以检测仅在某些器官中发生的变化。特定组织中的测量将是生成和修复之间平衡的快照，并且可能不代表其他器官中的过程。建议14：在测量提取的细胞或组织样品中核酸的氧化修饰时，必须非常小心，避免在制备和分析步骤中出现虚假氧化。目前最好的方法是对分离细胞进行单细胞凝胶电泳（使用DNA修复酶），以及用UPLC-MS/MS测定体液或从组织中提取的核酸中的8OHdG和8OHG。基于ELISA的方法，尤其是试剂盒形式的方法，通常未经充分验证，因此不建议使用。关于抗体的一些一般性评论如上所述，抗体已广泛用于检测蛋白质（例如羰基、3-硝基和3-氯酪氨酸）、DNA（例如8-oxodG）上形成的氧化产物（以及加合物）和脂质（F2-异前列腺烷）。例如，它们已用于ELISA、免疫组织化学和免疫沉淀形式，但经常遭受背景反应性、交叉反应性和缺乏特异性的困扰。为了解决这个问题，应记录用于生成抗体的表位（例如，对于HNE），并应包括消除背景的对照。建议使用表位的真实样品进行封闭以确定选择性。相对定量是可能的，但绝对定量可能很困难，例如，由于表位可及性较差（例如在蛋白质中氧化产物可能被掩埋）。此外，抗体通常是针对非结构化、化学修饰的肽产生的，并且识别的表位可能并不总是确定的。建议15：经过充分验证的针对特定产品的抗体在适当的护理和控制下使用时是有用的检测工具，包括针对非特异性相互作用的抗体。应尽可能包含具有真实表位的竞争数据。体内ROS和氧化损伤的测量体内ROS的测量是一个挑战。EPR方法已经开发出来，但尚未广泛使用。ROS检测的生物发光方法包括过氧笼状荧光素-1，其在氧化后原位形成荧光素，并在荧光素酶转染系统中被氧化以产生生物发光。如前所述，基因编码的氧化还原生物传感器已用于动物研究。随着灵敏度和检测方式的发展，正电子发射断层扫描现在被用于体内ROS成像，但仍处于起步阶段。在细胞和组织的线粒体中，可以使用靶向线粒体的硼酸MitoB来评估H2O2的变化，该硼酸MitoB在这些细胞器中积累，并被H2O2转化为MitoP。然后可以通过MS确定MitoP与MitoB的比率。临床试验中活性氧和氧化损伤的测量由于氧化损伤在许多人类病理学中起着核心作用，因此人们对开发治疗干预措施以减少这种损伤非常感兴趣。一个推论是，在临床试验中，我们应该能够证明这些干预措施如何影响氧化损伤。例如，许多双盲随机临床试验都是使用β-胡萝卜素、维生素C和维生素E等“抗氧化剂”进行的。这些通常无法影响疾病活动。不幸的是，在大多数情况下，没有测量干预措施对氧化损伤的影响，因此无法确定假定的治疗是否确实有效减少氧化损伤：如果不是，则可以预见缺乏效果。为了解决这个问题，有必要在临床试验中评估这些干预措施对患者氧化损伤水平的影响。目前，方法仅限于测量活检（例如皮肤或肌肉）或临床可获取的体液（例如血浆、唾液、痰或尿液，有时还包括脑脊液）中氧化损伤的终点。这些生物标志物包括核酸氧化的生物标志物，例如8OHG和8OHdG以及作为脂质过氧化生物标志物的F2-异前列腺烷。迄今为止，蛋白质氧化生物标志物在临床试验中的使用有限。然而，有证据表明蛋白质硫醇/二硫化物比例的改变以及蛋白质羰基和其他修饰的增加与病理学密切相关。更一般地说，临床试验应包括国际验证的生物标志物：理想情况下，生物标志物应经过实验室间比较。许多生物标志物依赖于血浆等体液中的浓度测量，但这些仅反映形成率和消除率之间的平衡，因此不能轻易解释为“氧化应激”。然而，已经开发出模型来估计某些生物标记物24小时的产量。理想情况下，应使用一组生物标志物，因为脂质、蛋白质和核酸氧化损伤的最终产物不一定相互关联，我们也不期望它们相互关联，因为它们是不同ROS的不同分子靶标。建议16：如果使用抗氧化剂进行干预，首先在初步剂量范围研究中使用生物标志物，以确定干预措施是否确实减少了相关生物分子的氧化损伤。它们应包括使用经过验证的方法和/或正交方法进行分析的明确的生物标志物。我们不建议在临床研究中使用d-ROMS测定、TBARS、总抗氧化活性测定或基于试剂盒的方法，其中试剂盒背后的方法学尚不清楚和/或尚未得到验证。结束语
本共识声明的目标是为来自不同领域的研究人员提供有用的资源，这些研究人员发现自己需要测量ROS并评估氧化事件以研究其生物学重要性。我们讨论了当前使用的许多程序的局限性，并提出了当前可用的最佳方法。未来不可避免地会开发和应用新技术，但我们的16条建议（图1）所阐述的谨慎原则将仍然有效。
根际互作生物学研究室 简介
