利用真菌扩张蛋白促进纤维素酶降解:预处理机制的结构解析

DOI：10.1016/j.biortech.2022.127434

写在前面

老板经常说，我们做固体废弃物处理的，现在要把眼光关注到如何将大分子糖类用最低的成本转化为小分子糖类，从而实现经济效益的最大化。万婷承担了部分工作，因此经常读一读这方面的文章，平时做实验也挺仔细的，加油成长。

概要

本研究对Talaromyces leycettanus JCM12802真菌扩张蛋白TlEXLX1进行了系统发育、协同作用、结构和作用机制的表征。在玉米秸秆和滤纸预处理中，TlEXLX1与商品纤维素酶表现出不同程度的协同作用。TlEXLX1通过结构域2与纤维素结合，通过CH -π与Tyr291、Trp292和Tyr327残基相互作用介导。结构域1中的Asp237、Glu238和Asp248残基与葡萄糖单元形成氢键，破坏纤维素基质内固有的氢键。研究鉴定了对纤维素结合至关重要的扩张蛋白氨基酸残基，阐明了扩张蛋白在细胞壁网络中的结构和功能;这在生物质利用方面有潜在的应用。

研究背景

1. 膨胀素（扩张蛋白）是一种非酶蛋白，通过降低分子间氢键强度使植物细胞壁松动，暴露由纤维素、半纤维素和果胶组成的多糖网络，增强纤维素的酶解作用。

2. 膨胀蛋白在结构上是一个小蛋白，包含两个结构域:结构域1形成一个糖苷水解酶家族45-like (GH45-like) β-桶状折叠;结构域2形成类似于II/III组草花粉过敏原的免疫球蛋白样褶皱;它是一种碳水化合物结合模块。

3.微生物可能通过水平基因转移和独立的结构域融合事件从植物获得扩张蛋白基因。大多数含有扩张蛋白基因的微生物是植物病原体。

系统发育分析——TlEXLX1属于EXLX家族

图1 对TlEXLX1及其同源蛋白的系统发育分析，用UniProt参考序列加入号来表示蛋白质。α-扩张蛋白(EXPA)、β-扩张蛋白(EXPB)、SWO和EXLX家族分别用蓝色、绿色、红色和黄色标记，TlEXLX1用黑盒子标记

TlEXLX1与celllic（一种商用纤维素酶）的协同作用

用Cellic与TlEXLX1联合水解滤纸和玉米秸秆，在反应中同时加入TlEXLX1和Celllic定义为处理A，单独用TlEXLX1(预处理体系)培养24 h后再加入Celllic定义为处理b，底物和牛血清白蛋白（BSA）缓冲液的预处理体系为对照。当滤纸用作Celllic和TlEXLX1的底物时(图a, b)。12 h后协同效应达到最大，还原糖产量分别提高到121%和140%。尽管BSA被认为具有类似于表面活性剂的作用，可以提高纤维素酶的水解能力，然而，使用0.4 μg/mL的牛血清白蛋白对该系统没有明显的协同作用。以玉米秸秆为基质时(图c,d)，处理B在12 h后协同效应达到最大，还原糖产量提高到130%。处理A在24 h时观察到最大的协同效应，还原糖产量增加到120%。这可能是由于与滤纸相比，秸秆的结构更复杂;因此，TlEXLX1作用需要更多的时间。总之，这些结果表明TlEXLX1和Cellic协同降解纤维素。

利用FTIR测定了经TlEXLX1处理的玉米秸秆的微观结构变化来进一步了解TlEXLX1促进纤维素降解的原因。峰形在波数上没有变化，但在吸光度上有显著差异。经TlEXLX1处理后，玉米秸秆的HBI降低了11.1% ，说明TlEXLX1与其他膨胀蛋白一样，可以通过促进纤维素无定形区形成，使植物细胞壁松动，从而提高纤维素酶的效率。

图2 TlEXLX1和Cellic对滤纸和玉米秸秆降解的协同效应。处理A (A)和处理B (B)不同反应时间对滤纸水解的协同效应;处理A (c)和处理B (d)不同反应时间对玉米秸秆水解的协同效应。点为平均值，中线为中位数，顶线和底线分别代表75%和25%分位数

TlEXLX1结构

通过测定TlEXLX1晶体结构来阐明其结构特点。它的晶体属于基心正交空间群C2221，分辨率为1.41 Å。采用分子置换法对其结构进行解析，以C. michiganensis expansin (4JCW_A)为搜索模型。结构细化后，最终的Rwork和Rfree值分别为0.1614和0.1756。电子密度图分析表明，多肽链从Ser172到Phe370残基依次排列。在Ser172之前的氨基酸在电子密度图中不可见。TlEXLX1是一个细长的椭圆形蛋白，包含两个由短连接体连接的结构域(残基275-278)。第一个结构域(D1，残基172-274)包含一个α-螺旋和8条β-链，形成类似gh45的β-桶状褶皱。第二个结构域(D2，残基279-370)包含由7条β-链组成的两个薄片，形成免疫球蛋白样β-三明治状碳水化合物结合模块(图3a)。它们可以形成平坦的表面，有助于配体结合。将TlEXLX1与典型的植物和微生物膨胀素进行比较(图3b)，发现它们的整体结构非常相似，特别是D1的β-桶状褶皱和D2的β褶片，均方根偏差分别为2.339 Å和1.124 Å。这些结果与EXLX的结构特征一致，说明TlEXLX1与植物和微生物膨胀素几乎没有差别。

图3 TlEXLX1的结构和结构叠加的结果。(a) TlEXLX1的总体结构。D1, D2和连接器分别为青色，绿色和品红，图显示了TlEXLX1的主要结构以及每个区域的氨基酸编号。(b) TlEXLX1在其结构同源蛋白上的叠加。2HCZ、3D30、TlEXLX1分别用黄色、青色、蓝色表示。

残基对TlEXLX1函数的贡献

为了研究TlEXLX1与纤维素相互作用的机理，构建了TlEXLX1 -纤维素寡糖复合物模型。观察到的TlEXLX1与纤维素寡糖之间的相互作用如图4a所示。为了研究纤维素结合，将纤维素结合间隙中的所有相互作用残基突变为Ala，并使用滤纸测定Cellic的DS比来确定所有变体的延伸活性。

在D1中，参与G7和G6葡萄糖氢键的Asp237、Glu238和Asp248残基对延伸活性至关重要，因为这些残基的Ala突变体表现出非常低的活性(<20%)或完全失活。Thr179与Asp248侧链形成氢键，与G8葡萄糖有不同寻常的相互作用，由于T179A完全失活，因此被认为是关键的；与Thr179表现出非直接相互作用的His246对细胞壁延伸活性很重要，因为H246A仅保留27%的活性。此外，Trp180的吲哚环与G9葡萄糖形成氢键，其氨基和羧基与G8葡萄糖形成氢键。Asn184侧链与G4葡萄糖形成氢键。这两个残基(W180A, N184A)的突变适度降低了活性(约50%)。在D2中，Tyr327与G4葡萄糖形成CH -π键，对细胞壁延伸活性至关重要，突变体Y327A仅保留了12%的活性;另外四个突变体(Y291A、W292A、Q331A和S332A)的活性中度降低(约50%)。其中Tyr291和Trp292分别与G9和G8形成CH -π相互作用。Gln331的酰胺态氮和酰胺态氧分别与G2和G3葡萄糖形成氢键。Ser332侧链与G1葡萄糖形成氢键。因此，TlEXLX1的D1与配体通过氢键相互作用，而D2与葡萄糖位点形成疏水相互作用和氢键。

为了进一步了解延伸活性的降低，采用QCM-D实时监测TlEXLX1的吸附。与缓冲液平衡5min后，纤维素膜达到恒定频率(图5)。当注入TlEXLX1溶液时，由于大量蛋白质吸附在膜上，观察到频率迅速下降。大约20分钟的吸附后，用缓冲液洗脱可逆吸附剂。为了更直观地比较突变体的不可逆和计算最大吸附量。野生型(WT) TlEXLX1的最大吸附量和不可逆吸附量分别为0.89 mg·m-2和0.84 mg·m-2。D2突变体中，Y291A和W292A的不可逆吸附量和最大吸附量几乎是TlEXLX1的70%，这与延伸活性的丧失是一致的。令人惊讶的是，扩展活性严重丧失的突变体Y327A的最大吸附量与TlEXLX1相同，但其不可逆吸附量在所有突变体中最低(0.55 mg⋅m-2)。Tyr291, Trp292和Tyr327的芳香环，分别对应于BsEXLX1中的Tyr125, Tyr126和Trp157，几乎平行于纤维素低聚糖的pyranose环平面(3.0-4.0 Å)，允许CH -π相互作用。这些相互作用是纤维素结合的主要原因。根据Y327A的实时结合动力学，纤维素的初始结合和锚定主要由Tyr291和Trp292调控。在纤维素被正确定位后，Tyr327在通过疏水相互作用增强纤维素结合方面发挥了重要作用。

在D1突变体中，Thr179、Asp237和Asp248的Ala突变体的结合能力保持不变;然而，它们的协同效率几乎或完全丧失，表明这些残基是TlEXLX1的催化残基。Thr179和Asp248在扩展蛋白和远亲酶中高度保守。Asp248的羧基对细胞壁伸展活性至关重要，与G7葡萄糖的C3羟基形成氢键。Thr179的羟基与Asp248的羧基形成一个保守的氢键。等效的苏氨酸也很可能对水解转糖基酶家族2和GH45中催化Asp的正确定位很重要。Asp237在扩展蛋白中也是保守的;其羧基氧与G6葡萄糖的羟基形成氢键，本研究的突变实验表明，Asp237的氢键对TlEXLX1的扩增活性至关重要。此外，一个非保守的Glu238与G6葡萄糖的羟基形成氢键。这个氢键不影响纤维素的结合;然而，它影响了每个变体的相对DS。由于E238A几乎完全丧失了其扩展活性，使得TlEXLX1的扩展活性降低。这表明Glu238对TlEXLX1的延伸活性有显著的促进作用。此外，Trp180、Asn184和Cys239的Ala突变体纤维素结合能力略有下降，其不可逆吸附量和最大吸附量接近TlEXLX1的80%，说明它们的氢离子含量较低，对纤维素的结合贡献不大。

图4 TlEXLX1与纤维素寡糖相互作用的示意图以及每个突变体的相对DS。(a) TlEXLX1与纤维素寡糖结合间隙中的氢键和疏水堆叠相互作用示意图。(b)各突变体的相对DS。

图5 tlxlx1突变体在QSX334上吸附的频率曲线。

TlEXLX1的分子机制

通过对TlEXLX1-纤维素寡糖复合物的结构分析和实验验证，我们认为TlEXLX1通过D2与纤维素结合，主要通过Tyr291、Trp292和Tyr327残基之间的CH-π相互作用介导。D1中的Asp237、Glu238和Asp248残基与葡萄糖单元形成氢键，并作为催化残基打破细胞壁基质多糖之间固有的氢键(图6)。

根际互作生物学研究室 简介