导语
什么叫做单细胞基因测序（Single-Cell Sequencing）？一句话说，就是在单个细胞水平上对基因组进行测序。2013年《自然》杂志认为该技术将改变生物界和医学界的许多领域。北京大学生命科学学院白凡老师就是这一领域的先行者，他率先将这一技术应用于外周循环肿瘤细胞的研究。向癌症的精准诊断和治疗迈进了更坚实的一步。
白凡
北京大学生命科学院生物动态光学成像中心研究员
中组部青年学者
癌症治愈的难点
癌症非常难以治疗的原因是癌细胞会进行广泛的多器官转移。转移主要是通过血液循环系统来进行的。在癌症病人的血液里面存在着一种循环肿瘤细胞。它们就像种子一样在血液里面循环着游荡着，然后去找寻适合它们生存的土壤，而一旦它们找到了这样的土壤就会去播散更多地转移。
癌症转移的过程
首先，在人体里面，细胞会经历很多的外界刺激，不断地复制、分裂，这个过程中会引起新的基因突变，使这些细胞获得特异的特性。如果它们摆脱了细胞跟细胞之间生长上的抑制，以及繁殖代数的限制，它们就会疯狂地生长，这就形成了原位的肿瘤。
原位的肿瘤在长大的过程中分泌出很多细胞因子，这些细胞因子会吸引形成血管的内皮细胞向肿瘤靠拢。这些血管一旦和肿瘤交互生长在了一起，就给肿瘤的生长提供了更多的养分和氧气。同时，也给予肿瘤进入血管提供了一个机会。
其中一些比较厉害的肿瘤细胞具有更强的迁移和爬行能力，能够穿出原来的位置进入到血管。 这些进入血管的肿瘤细胞随着身体的循环系统快速地播散到其他器官。
一旦它们在其它器官的毛细血管里再一次停留下来，就会启动另外的生物学过程，再一次地穿出血管，然后建立起一个转移灶。
这些转移过程得到了很好的研究。只是对肿瘤转移最关键的媒介——循环肿瘤细胞的研究一直非常的有限，其主要原因就在于技术手段的限制。
循环肿瘤细胞：找不到，测不了！
人类血液里面大量的是血红细胞，一毫升的血液里面有大概50亿个血红细胞，还有大量的白细胞。而在癌症病人的一毫升血液里面血仅仅能够找到几个到几十个的循环肿瘤细胞。从这几十亿个细胞里面去找寻这几个到几十个循环肿瘤细胞，用大海捞针来形容一点都不过分。
假设有了很好的手段把它们准确地捕获下来，还遇到的困难就是对这几个细胞至几十个细胞怎么去进行分析？现有的医学手段，生物学手段都是基于大量的细胞来进行的研究，对于这样的少量细胞，现有的技术无能为力。
单细胞测序技术
现在最前沿的就是单细胞测序技术。可以针对一个细胞，准确去获取它里面的基因组信息、转录组信息。把先进的单细胞的测序技术和循环肿瘤细胞这个关键的临床问题结合在一起，可以进行一个非常有创新性的研究。
首先，抽取癌症病人的外周血 （5-10ML),然后用这种单细胞的精确操纵和分离的办法，把癌症病人血液里面的循环肿瘤细胞准确地给分离出来。
然后，把这种细胞进行基因组的扩增。我们对标本的DNA的起始量要求要达到微克的量级。而我们从一个细胞里面能够分离出来的遗传物质只有皮克的量级，甚至更少。所以就有一个巨大的鸿沟。
这就需要使用单细胞测序的技术去把微量的DNA准确地、高保真地扩增出来。当获得足够量的DNA的物质之后，就可以进行标准的基因测序，辅助于生物信息学的手段进行分析，就可以得到很多重要的临床信息。
利用单细胞测序技术，医生究竟可以从癌症病人的血液里面可以获取怎样重要的信息呢？
1
获取循环肿瘤细胞全基因组拷贝数
这是一个典型的肺癌患者，原发癌发在肺部。然后发生了肝部的转移。把这个病人外周血中的循环肿瘤细胞进行准确地分离，并进行单细胞测序。
下图列出来的是从单个循环肿瘤细胞里面获取的全基因组基因拷贝数变化的模式。
前面就看到红红蓝蓝的线，从第一个开始到最后，分别表示了人类的染色体:从1号染色体到22号染色体，以及X、Y染色体。最上面一行是一个正常的细胞。人类是一个二倍体，所以当细胞没有发生变异时，我们是一个在二的拷贝数的一个平整的信号。下面的这些就是肿瘤的原发位、肿瘤的转移位，还有八个循环肿瘤细胞。
这些细胞上面有典型的基因组拷贝数的扩增和缺失。这是癌症细胞区别于正常细胞的一个典型的特征。正是因为有了这些基因的扩增和缺失，导致这个细胞获得了比正常细胞不受控制的生长能力以及更强的迁徙和转移的能力。
从血液里面获取这个癌症病人循环肿瘤细胞的全基因组拷贝数模式，它就像一个ID、一个指标一样去衡量这个病人的病情分型。
从下图可以看到，把不同癌症病人的循环肿瘤细胞的基因拷贝数变化模式放在一起去看，发现这些病人存在一定的相似性。他们都来自于肺癌的一个亚型，叫做肺腺癌。
下图上下分别展示了另外两个病人，他们来自于肺癌的另外一个亚型：小细胞肺癌。可以看到中间的这一群细胞和上下两个细胞存在着明显的差别。
这个分析就第一次证明了：对循环肿瘤细胞的基因组拷贝数的分析，能够对癌症的亚型进行鉴定和分离。
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获取和癌症发生有关的基因的点突变
对癌症来说，有一些基因被称为癌基因，有一些基因被称为抑癌基因。只有当癌基因和抑癌基因都正常工作的情况下，我们身体这辆汽车才能够平稳地行驶。癌基因的突变和抑癌基因的突变都是癌症发生的一个重要指征。
这个病人来到医院的时候，首先他是一个肺腺癌，然后他的原位的肿瘤组织里面发现了EGFR这样一个癌基因的突变。所以，医生给他制订了靶向的治疗，给他用了一种专门针对EGFR基因突变的药物。
一段时间的药物治疗之后，这个病人的病情得到了缓解。几个月之后，对他的血液进行循环肿瘤细胞的分离和测序。就奇怪地发现血液里面不仅仅可以看到EGFR基因的突变，同时还看到了PIK3CA基因的突变，还有RB1、TB53这两个抑癌基因的失活。
我们看到这个信息非常地紧张。为什么呢？因为PIK3CA基因的突变和肿瘤的耐药是直接关系在一起的，而RB1、TB53两个基因的失活直接和肿瘤从肺腺癌向小细胞肺癌的转化相关。
我们的这个预测很不幸地就被证实了。这个病人不久之后就出现了耐药反应，并且在他的肝部的转移位出现了向小细胞肺癌的转化。
及时反馈信息、提前预警可以为医生及时地改变治疗方案提供宝贵的时间！
癌症病人终于可免去穿刺之苦了！
这项技术和实际的临床治疗癌症有什么关系呢？
首先对现有的癌症检测方法作一个比较。如果有一个病人患了癌症去肿瘤医院， 需要给他进行癌症组织的鉴定和病理的分型，现在用的办法一般叫做活检，通俗地说叫穿刺。
穿刺一般是在超声的引导下，把一根针插入病人的器官患病的部位（如果是肺癌就是肺部）， 然后取一个很小的肿瘤标本出来做病理学的鉴定，检测基因的突变 。
这种方法有很大的一个隐患。首先，它的伤害性非常大，不可能在疾病治疗的过程中反复使用。再者，这种深层器官的穿刺容易造成内出血，甚至人为的造成肿瘤的播散和转移。
那么，如果能从血液里面把这些肿瘤细胞分离出来对它们进行基因测序以及病理诊断，就可以极大地避免当前活检所存在的巨大的危害。
有这样一个病人， 在他化疗前、一线化疗后、二线化疗后，我们对他进行循环肿瘤细胞的分离和测序。可以看到，在疾病治疗的过程中。他的基因突变图谱确实存在着一个动态的变化。而准确地获取这些信息对于医生及时地去修改治疗方案有着非常宝贵的意义。就是来自血液里面的循环肿瘤细胞的基因测序和分析可以实现对致癌关键基因的准确探测，并且通过基因拷贝数变化模式的这种鉴定可以为癌症的分型和预后提供重要的依据。
个体化医疗时代
基于以循环肿瘤细胞作为媒介的癌症血液检测，可以在我们的个体化医疗、精准医疗中发挥重要的作用。而且基于血液的检测是一种伤害性非常小的检测方式。正因为它伤害性非常小，可以在病人治疗的病程中可以反复地去使用，及时地跟踪病情进展，帮助医生及时调整治疗方案。
假设我们有十种抗肿瘤的药物，那这十种抗肿瘤的药物给病人使用的时候，大部分的情况下，医生是基于经验的判断，或者现阶段基于部分基因测序的结果来进行使用，这算不算得上是真正的个体化医疗呢？
我们如果能把循环肿瘤细胞从这个病人的血液里面准确地分离出来，然后在体外进行培养，把它培养成为一个系统的肿瘤细胞系，或者把它种植到免疫缺陷的老鼠身上构建一个人源的肿瘤老鼠模型，我们就可以在体外把这十种抗癌药物对这些细胞来分别来进行试用。看究竟哪一些药物能够更好地、有效地杀灭肿瘤，以此来实现真正的针对每一个人的个性化医疗。
癌症病人的血液里面不仅仅只有循环肿瘤细胞能够作为癌症标志物，它还有肿瘤分泌出来的循环肿瘤DNA和外泌体。如果能把血液里面的各种肿瘤标志物综合起来使用，可以极大地提升癌症早期预防和无创诊断的水平，能够造福广大的癌症患者！
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