【努力与收获】第一篇文章

“ 虽然失败面前，所有的努力都显无力；但是成功面前，再多的努力都是值得。” --科白君

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一作解读ISME | 气候变暖下微生物介导施肥减缓土壤有机碳的损失

原文：Microbial metabolism and necromass mediatedfertilization effect on soil organic carbon after long-term communityincubation in different climates

“牺牲小我，成就大我”。是的，土壤世界也存在。我们可以把“小我”想象成无数的微生物，而“大我”是它们的家—土壤。十年如一日，土壤始终培育着数不胜数的微生物。尽管微生物体型微小，但是它们功能强大，调控着土壤中碳、氮、磷、硫等养分循环。此时的你我很难想象微生物能够补充土壤碳。然而，正当持续的气候变暖袭来，它们甘愿奉献，将逝世后的身躯覆盖在土壤的外表，与土壤表面的矿物结合，通过物理保护防止土壤有机碳被高温分解。这种奉献精神属实让人敬佩。

尽管微生物需要消耗大量的碳源和氮源，但是它们并不贪心。因为，微生物明白“来之不易”的道理，通过代谢来权衡生活中的利弊。例如，当土壤中氮源不足时，植物会帮助微生物，将更多的光合产物投资于地下，根系微生物利用根系分泌物获得碳和能量，分泌更多的胞外酶，通过分解更多土壤有机质来挖氮。当氮源充足时，微生物便会安分守己，减缓自己的生长速度，因为挖氮也需要消耗能量。

实际上，这涉及当前土壤生态学研究中两大重要的概念：土壤微生物碳泵理论(Liang et al, 2017)和掘氮假说(Fontaine et al, 2011)。18年，我有幸在指导老师梁玉婷研究员的课上接触到土壤微生物碳泵理论，这个理论突破了我对微生物的认知。该理论表明微生物通过体外修饰和体内周转来调节土壤碳的积累，这意味着微生物代谢产物或残体作为难降解碳源对有机碳的贡献很大。然而，在此之前，我一直认为植物残体是土壤碳的唯一来源。我和梁老师交流、讨论后，为了更好地理解微生物作用与土壤有机碳组分的关系，在研究过程中我们把土壤有机碳分成不稳定碳和稳定碳。考虑到土壤碳和氮循环紧密耦合，长期施肥改变土壤养分的有效性并持续地影响土壤碳储量。尽管施肥具有增加土壤碳储量的潜力，但长期而言，土壤碳的稳定性取决于未来气候变化，这与微生物代谢、酶活性和残体微生物周转密切相关。因此，在土壤微生物碳泵理论基础上，为了更好地理解农业土壤有机碳的积累和稳定性，我们需要进一步研究不同气候条件和长期施肥下微生物的生理代谢和残体对土壤不稳定碳和稳定碳的贡献。

2021年3月12日，中科院南京土壤研究所梁玉婷团队在ISME杂志在线发表了题为Microbial metabolism and necromass mediatedfertilization effect on soil organic carbon after long-term communityincubation in different climates 研究。这项工作强调了微生物代谢及残体对长期添加养分的土壤有机碳中难降解碳的实质性贡献。接下来我分“实验方法”和“实验结论”为大家介绍这项研究。

实验方法

本研究的实验设计思路：1.基于长期土壤移置实验平台，利用固态¹³C核磁共振技术测定施肥和不同气候条件下土壤有机碳及其官能团的变化；2.利用PMA方法，研究活体微生物群落对施肥及不同气候条件的响应，再分析这种响应与土壤有机碳组分的关系，并利用单细胞拉曼光谱结合重水标记(Raman-D₂O)验证不同气候条件下活体微生物对不同碳源的代谢活性；3.进一步利用活体微生物微观培养实验，酶活的测定及土壤氨基糖标记实验，揭示长期施肥和不同气候条件下土壤微生物的生理代谢及残体对土壤不稳定碳和稳定碳的实质性贡献。

土壤移置实验

本研究基于长期土壤移置试验平台(Soil transplantation)(Sun, 2014)，该试验从2005年将寒温带地区的大断面(transect)黑土样带移至华中暖温带和华南的中亚热带地区，以模拟田间的不同气候条件，并于顶部进行施肥处理。长期土壤移置试验被认为是模拟自然条件下多种环境因素综合变化直观的且有效的方法。毫无疑问，这项试验是伟大的。为什么这么说？可想而知，随着人类活动加剧了全球气候变化，这带有预见性的且大胆的设计实在让人惊叹。这个试验能实现同种土壤类型经历跨气候，以便更好地模拟研究气候变化下土壤生态学等相关领域科学问题。但是，这里有些问题值得大家关注：

土壤移置实验是跨气候带，温度和降雨等因素是突变的，而真实的气候变化是一个逐渐的过程。因此，在描述土壤移置实验带来的环境因素变化不能与真实的气候变化直接划等号。特别是，我们要注意用词和描述。
土壤移置实验带来的气候突变是短暂的。正如本研究中，在施肥处理的基础上，经过12年不同气候条件下的长时间群落培养，已成为微生物适应试验。因此，我想说的是土壤移置带来的气候突变影响可能只在刚移置的头1-3年。
土壤移置实验是否受当地土壤的影响？本研究在OTU水平上，使用贝叶斯方法来识别移置后黑土中细菌群落的潜在来源(图S3)。Trans1移置后土壤微生物最大的潜在来源是原位黑土，占69%，其次是未知来源的21%，只有10%来自当地土壤(潮土)。TransS2也得到了类似的结果。这些结果表明，只有一小部分微生物来自当地土壤，当地土壤影响较小(潮土和红壤)。

图S3 溯源追踪原位黑土、当地潮土(TransS1处理)和当地红壤(TransS2处理)的土壤细菌来源

溴化丙锭方法

我们发现，大多数的研究都提取了土壤微生物的全部DNA，这很难区分和量化活体微生物和残体微生物在有机碳中的介导作用。据报道，平均40%的DNA来自细胞外或不完全细胞(死微生物) (Carini, 2016)。如果从死亡细胞中提取DNA可能会高估多样性指标(Yergeau, 2010)。因此，本研究采用了溴化丙锭(Propidium monoazide, PMA)的方法来去除死细胞的DNA (Nocker, 2007)。PMA是一种非膜性染料，可选择性地穿透细胞膜受损的细胞。理论上可以从整个群落中区分出来活体微生物。

然而，由于PMA吸附土壤颗粒或PMA的光活化效果不佳(Carini, 2016)，我们需要进行预实验，以确定加入PMA后，确保土壤样品中死细胞的DNA尽可能被去除。此外，在进行PMA处理前，我们应该确定PMA的浓度和土壤悬浮液的浓度，证明该PMA剂量的可行性(也就是说在增加PMA浓度之后，提取出来的DNA质量没有变化)。

单细胞拉曼光谱结合重水标记

本研究为什么采用单细胞拉曼光谱结合重水标记(Raman-D₂O)来验证不同气候条件下微生物对不同碳源的代谢活性？拉曼显微镜最近被用于研究土壤微生物。重要的是，它对细胞是无损的，并且微生物细胞光谱可以在几秒钟完成测量(Li, 2019)。Raman-D₂O在本研究中研究微生物代谢过程有几个优势。第一，单细胞拉曼光谱可以准确区分C-H和C-D峰。用D₂O标记后，我们可以通过观察微生物细胞对D₂O的吸收来判断其代谢活性。第二，我们的研究目的是验证微生物在不同碳源上的代谢活性，而不是研究某种底物及其代谢产物的特定代谢过程。这个过程中具有广泛代谢活性的细胞可以被捕获。第三，与¹³C稳定同位素标记法相比，D₂O标记法更简单、更经济。然而，我们进行土壤方面的单细胞拉曼实验时要采用新鲜的土壤样本，不建议用-80℃冷冻的历史样本。由于对细胞活性的要求较高，如果用-80℃的冷冻历史样本(细胞活性不够)一般需要较高的激光强度，容易将细胞击穿而毁坏样本。

土壤氨基糖标记残体微生物

基于土壤微生物碳泵理论，应该如何展开残体微生物的实验？根据文献，我们可以通过测定土壤氨基糖含量来表征土壤残体微生物(Zhang, 1996)。为什么选择这种标记物？首先，氨基糖是微生物细胞壁的重要成分，在微生物死亡后仍然可以在环境中保存很长时间，因此土壤中的氨基糖主要来自于长期积累的微生物残体(Joergensen,2018)。此外，土壤中常见的氨基糖包括氨基葡萄糖、氨基半乳糖、甘露糖氨和胞壁酸。其中，氨基葡萄糖和胞壁酸是特异性标记物，土壤中的氨基糖主要来自真菌，而胞壁酸只来源于细菌。目前来看，土壤氨基糖是作为残体微生标记物的最佳选择。

实验结果

本研究的主要实验结果：

1.土壤移置12年后，施肥使土壤有机碳含量减少较少，其中芳香族碳(aromatic C)增加，烷氧碳(O-alkyl C)和羰基碳(Carbonyl C)的消耗减少；

2. 活体微生物的网络模块化解释了60.4%不稳定碳的变化，并利用拉曼光谱结合D₂O同位素标记，证明了土壤向南移置后细菌对不稳定碳(淀粉)的代谢活性更高；

3. 与不施肥相比，在较温暖的气候条件下，施肥显著降低了土壤α-和β-葡萄糖苷酶活性，延缓了微生物的生长；

4. 施肥显著增加了由土壤中氨基糖标记的残体微生物，其对土壤稳定碳的贡献为22.3%；

不同气候条件下施肥对有机碳及官能团影响

根据实验设计思路，第一步先明确不同气候条件下，施肥对土壤有机碳及其官能团的影响。经过12年土壤移置，在较温暖的气候条件下(TransS2处理)，土壤有机碳的损失明显较少(图1)。我们进一步利用核磁共振技术确定有机碳分子官能团的变化(图1)。施肥显著提高了TransS2土壤稳定碳中芳香碳含量。Trans2施肥土壤的芳香性是TranS1的2.7倍，表明在较温暖的气候条件下，施肥增加了腐殖质化。对土壤不稳定碳而言，未施肥土壤中的烷氧碳和羰基碳含量降低；施肥明显减缓了气候变暖条件下土壤不稳定碳的损失。施肥降低了TransS2中烷基/烷氧基的比例，表明可能抑制了易降解碳的消耗。

图1 不同气候条件下施肥对有机碳及其分子官能团的影响

活体和全体微生物群落与有机碳组分的关系

既然已经清楚土壤有机碳的变化，我们接下来就要明确微生物和土壤有机碳之间的关系。我们分析了长期施肥对活体和总体微生物群落组成和结构。发现施肥显著改变了不同气候条件下细菌群落的组成和结构(图2a，图S4)。我们发现活体和全体微生物群落对不同气候和施肥的响应存在差异，也意味着区分活体和死体是有必要的，特别是在量化关系时。了解施肥和气候变化对微生物群落影响后，我们进一步探究活体和总体微生物群落对不稳定碳和稳定碳的解释。这里，我们利用随机森林模型，发现有五个模块来自活体微生物，对不稳定碳的变化有更高的解释贡献(60.4％) (图2b)，这意味着活体对不稳定碳的影响更大，主要表现在微生物对不稳定碳的分解代谢。

图2 活微生物和总微生物群落的组成和模块化 a活菌群落和总菌群落组成的比较 b随机森林模型中活微生物和总微生物网络模块对土壤不稳定碳组分变化的贡献

图S4 气候因子、土壤地球化学属性与细菌群落结构的典范对应分析

此外，我们发现全体微生物网络模块化(78.81％)比活微生物(70.69％)解释了稳定碳的更多变化(图S9)，并且SEM结果显示，全体微生物群落对稳定碳组分表现出积极的贡献(图S10)，这也意味着残体微生物可能才是土壤中稳定碳的主要贡献者。这也是为什么后面我们会展开残体微生物研究的原因。

图S9 活体和全体微生物网络模块化预测土壤稳定碳组分的变化

图S10 年平均温度、土壤地球化学属性和总微生物对不稳定碳和稳定碳的贡献

由于我们发现施肥对土壤有机碳的影响及微生物群落的影响。因此，我们想进一步在施肥土壤中利用单细胞拉曼光谱结合重水同位素标记的方法(Raman-D₂O)研究了活菌的代谢活性，以验证其在土壤向南移置后的降解能力(图3)。使用D₂O进行底物代谢的细菌培养在2040-2300 cm^-1范围内显示出明显的C-D拉曼光谱(图3a)。TransS1和TransS2中C-D与(C-D + C-H)的比例显著高于以淀粉为碳源的原位结果，而纤维素为碳源的情况则相反(图3b)。

图3 Raman-D₂O研究了不同碳源（淀粉和纤维素）在施肥土壤中的土壤细菌的代谢活性 a 淀粉 b 纤维素

微生物代谢及残体对土壤有机碳的贡献

为了进一步揭示微生物的生理代谢及残体在长期施肥和不同气候条件下对土壤不稳定碳和稳定碳的贡献。我们进行了微生物代谢的微观实验、酶活性的测定以及土壤氨基糖的测定。结果发现施肥显著降低了TransS2中土壤α-和β-葡萄糖苷酶活性(图4a)。通过接种土壤悬浮液测试了活体微生物对不同碳源(淀粉和纤维素)的分解能力(图4b)。结果表明，施肥显著降低了淀粉和纤维素分解所产生的CO₂。这表明，在TransS2中，施肥减少了不稳定碳和稳定碳的损失。此外，分别测定了活菌在淀粉和纤维素中的生长曲线(图4c)。在较温暖的气候条件下，施肥土壤中细菌的生长活性低于未施肥土壤。特别是在淀粉碳源中，施肥土壤中的细菌加速进入稳定期，而未施肥土壤中的细菌持续生长。

图4 不同气候条件下土壤微生物对不同碳源的代谢能力及生长情况 a土壤酶活性(α-和β-葡萄糖苷酶) b微生物降解淀粉和纤维素的微观实验 c活体微生物在淀粉和纤维素碳源中的生长曲线

土壤氨基糖作为残体微生物的标志物。我们结果表明，在TransS2中，施肥显著增加了微生物残体的数量(图5a)。移置12年后，微生物残体的积累增加了。使用部分冗余分析估算了活的和死的微生物以及土壤地球化学属性对不稳定碳和稳定碳组分的贡献(图5b)。结果显示，活体微生物对不稳定碳组分的贡献为30.9％，远高于死微生物(1.1%)的贡献。对于稳定碳，残体微生物的贡献为22.3％，大于活微生物的贡献(6.4%)。该结果部分证明了前面随机森林和SEM的结果，表明残体微生物可能是形成土壤稳定碳的主要贡献者。

图5 微生物残体对有机碳的贡献 a土壤中氨基糖含量作为坏死性生物标志物 b部分冗余分析估算土壤地球化学属性、活细菌生物量和死细菌氨基糖对土壤不稳定碳和稳定碳的影响

结论

通过对不同气候条件下长期施肥的综合研究，我们探讨了氮添加对有机碳及其分子官能团的影响、微生物在单细胞水平上的代谢活性以及氨基糖作为微生物坏死的标志物的变化等因果关系。本研究构建了一个概念框架，揭示了微生物生理代谢和残体对氮缺乏和充足条件下土壤有机碳封存的潜在调控机制(图6)。在温暖的气候下，施肥补充土壤稳定碳(芳香碳)，通过促进微生物残体的积累。另一方面，由于激发效应较小，活体微生物对有机碳不稳定碳组分(如烷氧碳、羰基碳等)的消耗较少。具体的解释：不施肥的情况下，由于氮的限制，植物和微生物可能发出更高的氮饥饿信号，微生物产生更多的细胞外酶来分解有机质以获得氮源。此外，氮素缺乏减少了植物根系分泌物(易降解碳源)的输入，升温加速了土壤不稳定碳的消耗，进一步刺激了微生物对土壤稳定碳的呼吸，导致土壤有机碳的减少。在施肥的情况下，土壤微生物坏死量的增加补充了土壤不稳定碳的含量，低氮饥饿信号减少了微生物对土壤稳定碳的消耗。

本研究突出了施肥和不同气候条件联合效应下微生物代谢和残体对土壤有机碳封存的重要贡献。研究结果为温暖气候条件下构建土壤有机碳的农业管理提供了新的思路。与一般观点相反的是，养分或易降解碳的添加也可以长期增加土壤有机质，这对于预测土壤碳库动态和促进碳封存来应对气候变化是至关重要的。在农业管理中，秸秆等难降解碳源形成土壤有机质是一个长期的过程。因此，将有机碳从不稳定态转化为持久性合成态的微生物持续转化是农业生态系统中储存有机碳的一种可行的方法。

图6 不同气候条件下微生物对土壤有机碳分子官能团的潜在调控机制示意图注：土壤颜色梯度反映了不稳定碳和稳定碳组分的变化，土壤高度代表了SOC含量

微生物残体补充土壤碳的话题逐渐成为土壤生态学等相关领域的研究热点，但是土壤有机碳的形成除了微生物的生理代谢和残体微生物，还包括植物根系分泌物和残体凋落物。因此，探究植物-微生物-土壤三者之间的关系，更有助于我们理解土壤有机碳的稳定性。在这个过程中，我们可以借助多组学技术及稳定同位素标记等方法来破译土壤里的“黑箱”。

关于残体微生物，有几个问题值得大家思考。微生物死后，其残体会与土壤表面的矿物结合形成复合体，通过物理保护阻碍它们被微生物分解。是否可能存在微生物残体与残体之间形成复合体，也能长期保留在土壤中？不同种类的微生物，例如真菌和细菌形成的微生物残体一样吗？气候变化下这种残体-残体复合体如何变化？它们如何影响土壤有机碳的数量和质量？等等。我们仅仅打开了微生物残体的冰山一角，土壤中还有无数的奥秘等待我们去探索。

最后，我想说一篇文章的发表离不开所有人的共同努力。我特别感谢梁老师的指导，感谢团队里小伙伴们的帮助，感谢帮助过这项研究的所有工作人员。

参考文献

Liang C, Joshua P, et al. (2017). The importance of anabolism in microbialcontrol over soil carbon storage. Nature microbiology
Fontaine S, Henault C, Aamor A et al. (2011). Fungi mediate long term sequestration of carbon and nitrogen in soil through their priming effect. Soil Biology & Biochemistry
Sun B, Wang F, Jiang Y et al. (2014). A long-term field experiment of soil transplantation demonstrating the role of contemporary geographic separation in shaping soil microbial community structure. Ecology and Evolution
Carini P, Marsden PJ, Leff JW, et al. (2016). Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature microbiology
Yergeau E, Hogues H, Whyte LG et al. (2010). The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR and microarray analyses. The ISME Jounal
Nocker A, Sossa-Fernandez P, Burr MD, et al. (2007). Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and EnvironmentalMicrobiology
Li H, Bi Q, Yang K et al. (2019). D2O-isotope-labeling approach to probing phosphate-solubilizing bacteria in complex soil communities by single-cell raman spectroscopy. Analytical Chemistry
Zhang X, Amelung W. (1996). Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology &Biochemistry
Joergensen RG (2018). Amino sugars as specific indices for fungal and bacterial residuesin soil. Biology and Fertility of Soils

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